糖尿病肾病（diabetic nephropathy，DN）是糖尿病的主要并发症之一，是终末期肾病的主要原因，增加了糖尿病患者的死亡率^[1]。DN的病理特征主要表现为肾小球肥大，基底膜增厚，足细胞凋亡，细胞外基质沉积等。研究表明，30%~40％的糖尿病患者并发DN。DN的发病因素多样，包括高血糖、晚期糖基化终末产物、血管紧张素Ⅱ、氧化应激和促炎细胞因子等^[2]。由于DN具体发病机制较为复杂，目前尚不明确，治疗方法有限，主要包括控制血糖、控制血压和控制血脂等，但众多DN患者仍然不可避免地发展为终末期肾病^[3]，因此，探索DN的发病机制和寻找其治疗靶点至关重要。

长链非编码RNA（long non ⁃ coding RNA，lncRNA）是长度>200个核苷酸的非编码长链RNA^[4]。研究表明，lncRNA是多种生物过程的重要调节因子，广泛参与了增殖、纤维化、凋亡等生物学过程，在乳腺癌、骨肉瘤和胃癌等癌症疾病和糖尿病等代谢性疾病中发挥了重要作用^[5-9]。Yin等^[10] 发现lncRNA TUG1可以调节胰岛β细胞功能，降低incRNA TUG1的表达后β细胞凋亡率增加，胰岛素分泌减少，从而调节糖尿病的发生。目前，lncRNA在DN中的作用也逐渐显现^[6]，它可从影响肾纤维化^[11]、介导肾脏炎症^[12]、调节肾小球系膜细胞的增殖和凋亡^[13] 和足细胞损伤^[14] 等多方面参与DN的发生发展。本课题组前期通过lncRNA芯片对DN小鼠和正常对照小鼠的肾组织进行差异lncRNA筛选，发现lncRNA 127391在DN小鼠中较正常小鼠表达显著降低，因此推测lncRNA127391可能在DN发生中发挥重要作用，并于前期成功构建重组质粒pCDH⁃lncRNA 127391^[15]。本研究将重组质粒pCDH ⁃ lncRNA 127391转染小鼠肾小球系膜细胞（mice mesangial cell，MMC）细胞，并观察MMC细胞的增殖和纤维化等指标的变化。

1 材料和方法

1.1 材料

MMC（中国科学院上海细胞库）；DMEM培养基、胎牛血清（Gibco公司，美国）；Lipofectamine^TM 2000脂质体（Invitrogen公司，美国）；抗FN抗体、抗 α⁃Tubulin抗体（Abcam公司，美国）；抗Col⁃1、抗CyclinD1抗体、抗PCNA抗体（Proteintech公司，美国）；CCK8试剂盒（Dojindo公司，日本）；Annexin V FITC Apoptosis Kit凋亡检测试剂盒（BD公司，美国）

1.2 方法

1.2.1 动物实验

8周龄雄性C57BL/KSJ小鼠购自南京大学动物模式研究所，分为db/db组和db/m对照组，适应性喂养1周后，测量体重血糖并用ELISA法检测24h尿白蛋白定量（UAE），待db/db小鼠UAE显著升高时，取小鼠肾组织，并行HE及PAS染色，确定DN诊断^[16]。本研究经南京医科大学动物护理与伦理委员会批准实施。

1.2.2 细胞培养

为了模拟正常与糖尿病生理环境，将MMC细胞分别培养在葡萄糖浓度为5、15、25mmol/L并含有10%胎牛血清的完全培养基中，置于37℃、5%CO₂ 的细胞培养箱中培养，每2~3d换新鲜培养基。取生长良好的3~8代细胞行功能试验。

1.2.3 质粒转染

将MMC细胞分成对照组（pCDH）和过表达lncRNA127391组（lncRNA127391）。将MMC细胞按每孔1×10⁵ 个细胞的密度接种于6孔板中，每孔加入2mL DMEM培养基。置于37℃、5%CO₂的细胞培养箱中静置过夜培养。按照Lipofectamine^TM2000说明书，将pCDH和pCDH⁃lncRNA127391分别转入MMC细胞中，置于细胞培养箱中静置培养6h后，更换为完全培养基，置于培养箱中继续培养48h后，在荧光显微镜下观察，并收取细胞进行后续试验。

1.2.4 RT⁃qPCR试验

TRIzol试剂提取细胞和组织的总RNA。按照HiScript Ⅱ Q RT SuperMix（南京诺唯赞）试剂盒说明书行逆转录反应生成cDNA，参照ChamQ SYBR qPCR Master Mix（南京诺唯赞）试剂盒说明书行PCR扩增，扩增条件：预变性95℃ 30s；循环反应95℃ 10s、60℃ 30s共40个循环；熔解曲线95℃ 15s、60℃ 60s、95℃ 15s。LncRNA 127391上游引物：5′ ⁃ GCTCTAGAGCTATGATTTTTTTCATTGTAG⁃ GTGAGCTCC ⁃ 3′，下游引物：5′ ⁃ CGGGATCCC⁃ GGGATATTCATGTTGCTT⁃3′；β⁃actin上游引物：5′⁃ GTGACGTTGACATCCGTAAAGA⁃3′，下游引物：5′⁃ GCCGGACTCATCGTACTCC⁃3′

1.2.5 蛋白质免疫印迹

在细胞样本中加入适量配制好的含有PMSF的蛋白裂解液，置于冰上，每10min涡旋10s，涡旋3次后，4℃、13 000r/min离心15min，吸取上清至新的1.5mL EP管中。将蛋白样品用SDS⁃PAGE电泳分离后，转至PVDF膜，用5%脱脂奶粉溶液封闭1h后，一抗孵育4℃过夜，次日回收一抗，用TBST漂洗PVDF膜后加入相应的二抗，室温下孵育1h后用TBST漂洗。随后曝光显影。

1.2.6 CCK8实验

将MMC细胞分别以2 000个/孔的密度接种于96孔板中，每孔加入100 μL完全培养基，每组设置6个重复孔，共铺种5块板。放入37℃、5%CO₂的培养箱中培养，分别于24、48、72、96h后取出，每孔各加入10 μL CCK8试剂，放入培养箱中孵育1h，用酶标仪测定在450nm波长处的吸光度值。

1.2.7 凋亡实验

将MMC细胞以5×10⁵ 个/孔的密度接种于6孔板中，置于37℃、5%CO₂培养箱中培养24h后，按照BD Annexin V FITC Apoptosis Kit凋亡试剂盒说明书操作，细胞消化后离心，用预冷的PBS洗2遍，重悬于100 μL 1×Binding Buffer，随后分别加入5 μL的Annexin V⁃FITC和5 μL PI染色，轻轻混匀细胞，并在室温避光处放置15min，加入400 μL 1×Binding Buffer，混匀后在1h内使用BD流式细胞仪检测结果。

1.3 统计学方法

实验结果使用SPSS22.0软件进行统计学分析和作图，实验数据以均数±标准差（$\stackrel{-}{x}$ ± s）表示，CCK⁃ 8实验中两组间比较采用双因素方差分析检验（two⁃ way ANOVA），考虑处理条件及时间两个因素的影响，其余两组间比较采用 t 检验，P< 0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 lncRNA 127391在DN小鼠肾组织及高糖MMC细胞中低表达

db/db组小鼠血糖、体重、尿量、24h尿蛋白定量较db/m对照组小鼠均显著升高，差异均有统计学意义（P< 0.05，表1）

HE染色结果显示，与db/m小鼠相比，db/db小鼠表现出典型的DN病理改变，其系膜基质增生、基底膜增厚（图1A）。RT⁃qPCR检测lncRNA 127391相对表达量，结果显示，db/db小鼠肾组织中lncRNA 127391表达显著低于db/m小鼠肾组织（图1B）。且随着葡萄糖浓度的升高，MMC细胞中lncRNA 127391表达水平逐渐降低（图1C）。

2.2 重组质粒pCDH⁃lncRNA127391转染MMC细胞

将空载对照pCDH和pCDH⁃lncRNA 127391分别转入MMC细胞后培养48h，荧光显微镜观察到绿色荧光表达（图2A）。RT⁃qPCR结果显示，转染重组质粒pCDH⁃lncRNA127391后，MMC细胞中lncRNA 127391表达量显著高于对照组（图2B）。

2.3 过表达lncRNA 127391 抑制MMC细胞增殖和纤维化

蛋白质免疫印迹结果显示过表达lncRNA 127391后，MMC细胞中纤维化标志物FN、Col⁃1的蛋白表达量和增殖标志物CyclinD1、PCNA的蛋白表达量显著降低（图3A）。CCK8实验结果显示，过表达lncRNA 127391组的MMC细胞增殖速度低于对照组（图3C）。结果表明lncRNA 127391可抑制MMC细胞的增殖。

2.4 过表达lncRNA 127391促进MMC细胞凋亡

通过流式细胞术检测细胞凋亡水平，结果显示，过表达lncRNA 127391组的MMC细胞凋亡数显著高于对照组，表示lncRNA 127391可能促进MMC细胞凋亡（图4）。

3 讨论

lncRNA是一类参与多种生物学进程和疾病发展的非编码RNA，其既可以定位于细胞核，也可以定位于细胞质。核lncRNA可通过多种方式介导表观遗传调控，包括表观转录和转录后修饰，调控方式包括染色体修饰、转录干扰或转录激活。细胞质中的lncRNA可以起到分子海绵的作用，与microRNA结合，间接增强蛋白质的表达^[17-18]。多项研究表明，lncRNA影响了多种癌症的发展。有学者发现， lncRNA PCAT19可以促进前列腺癌生长、侵袭和转移^[19]。在另一项研究中，研究人员发现，lncRNA REG1CP结直肠癌中表达显著上调，促进结直肠癌发生^[20]。lnc00491可促进食管鳞癌细胞增殖和抑制其凋亡，与食管癌预后不良相关^[21]。lncRNA在糖尿病及其并发症中同样起着重要作用，研究表明，lncRNA在调节β细胞功能，胰岛素分泌和胰岛素抵抗的发育中起重要作用^[22-24]，影响糖尿病的发生。在糖尿病并发症中，lncRNA的作用也不可忽视。 lncRNA MALAT1促进包括糖尿病视网膜病变，糖尿病心肌病变等糖尿病并发症的发生^[25]。DN，作为糖尿病的常见微血管并发症之一，是造成糖尿病患者死亡的重要原因之一，同时也是导致终末期肾病的主要原因。研究发现，lncRNA PVT1，RP23、MGC和ASncmtRNA2等可通过靶向转化生长因子⁃β1途径促进细胞外基质的积聚^[6]，促进DN的发生。Huang等^[26] 发现，lncRNA NEAT1可以激活Akt/mTOR信号通路而参与DN的发病。

本课题组前期已成功构建lncRNA 127391过表达质粒。本研究将lncRNA 127391过表达质粒转染MMC细胞，通过免疫印迹实验发现，过表达lncRNA 127391后细胞增殖标志物和细胞纤维化标志物蛋白表达均下降，CCK8实验表明过表达lncRNA 127391后，细胞增殖速度较对照组减慢。以上结果表明，lncRNA 127391可抑制MMC细胞的增殖和纤维化。流式分析结果显示，过表达lncRNA 127391后，MMC细胞凋亡数增加。

综上所述，本研究验证了lncRNA 127391在DN中低表达，并通过转染过表达lncRNA 127391重组质粒，进一步揭示了lncRNA 127391在DN中具有抑制肾小球系膜细胞增殖和纤维化的作用，但lncRNA 127391在DN中的发病机制有待深入探究。

参考文献