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急性肾损伤（acute kidney injury，AKI）是致病因素引起的短时间内肾脏功能急剧下降和/或肾实质损伤，在临床极为常见，在住院患者中的发生率为2％~12％，重症监护室患者可高达30％[1]。AKI增加了肾脏病患者进展到终末期的风险，导致预后不良，尤其是同时发生肾功能下降和肾实质损伤的患者[2]。引起AKI的病因很多，如缺血⁃再灌注损伤、烧伤、药物毒性、脓毒症等，其中脓毒症所致AKI占临床AKI的比例不断增加，占到AKI病因的29.6％~47.6％[3]。AKI又能加重其他脏器损伤，引起多器官功能障碍。与非脓毒症性AKI和单纯脓毒症患者相比，合并AKI的脓毒血症患者预后明显变差，病死率在50％~80％[4]。如何防治AKI已经成为全球性的公共卫生问题，是肾脏病学及重症医学面临的重要挑战。
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氧化应激是脓毒症肾损伤的重要机制之一。线粒体是肾小管细胞产生活性氧（reactive oxygen species，ROS）的主要来源。脓毒症时，肾组织受全身炎症反应的影响，ROS生成增多，最终引起脓毒症肾损伤[5]。调节ROS和氧化应激状态可能成为脓毒症肾损伤的潜在治疗靶点。线粒体途径是经典的细胞凋亡信号通路。近来研究发现，ROS爆发涉及线粒体途径的细胞凋亡[6]。肿瘤细胞局部高浓度ROS能引起线粒体膜通透性转运孔开放，跨膜电位降低，细胞色素释放并激活半胱氨酸蛋白酶Caspase，通过下游级联反应导致DNA碱基断裂，诱导凋亡[7]。但脓毒症肾细胞损伤中氧化应激和Caspase途径细胞凋亡的研究还较少。
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模式识别分子通过模式识别受体作用于肾小管上皮细胞，诱导炎症反应和组织细胞损伤。脓毒症时，病原体相关分子模式被体内的模式识别受体识别，引发炎症反应；革兰阴性细菌外膜的脂多糖（lipopolysaccharide，LPS）是目前脓毒症中研究最多的外源性模式识别分子[8]。H2O2能在短时间内提高细胞中氧化应激水平，且涉及多种信号通路，被广泛用于体外诱导氧化应激损伤的细胞模型[9]。本研究通过LPS刺激建立人肾小管上皮细胞HK⁃2的脓毒症细胞模型，用H2O2和Caspase3特异性肽类抑制剂Ac⁃DEVD⁃CHO单独或联合干预细胞，观察Caspase依赖的氧化应激对肾小管上皮细胞损伤的调节作用，探讨脓毒症肾小管上皮损伤的机制。
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1 材料和方法
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1.1 材料
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人肾小管上皮细胞HK⁃2细胞购自中科院典型培养物保藏中心，用含10％胎牛血清、100U/mL青链霉素双抗的DMEM/F12培养基，在37℃、饱和湿度的二氧化碳培养箱中培养。
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兔抗人Cleaved⁃Caspase3多克隆抗体、兔抗人Cleaved⁃PARP多克隆抗体和兔抗人β⁃actin多克隆抗体（ABI公司，美国）；酶标羊抗兔IgG（南京建成生物工程研究所）；H2O2、Caspae3抑制剂Ac⁃DEVD⁃ CHO（上海碧云天生物技术研究所）；MTT试剂盒 （上海生工生物工程有限公司）；Annexin V/PI凋亡检测试剂盒（BD公司，美国）；DHE试剂盒（Invitro⁃ gen公司，美国）。凝胶成像系统（Bio⁃Rad公司，美国），流式细胞仪（BD公司，美国）。
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1.2 方法
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1.2.1 脓毒症细胞模型分组
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用终浓度10 μg/mL的LPS处理12h建立脓毒症细胞模型，分为：阴性对照组（不做处理）、过氧化氢组（H2O2 300 μmol/L）、Caspase抑制剂组（Ac ⁃ DEVD⁃CHO 15 μmol/L）、Caspase抑制剂+过氧化氢组（H2O2 300 μmol/L+Ac⁃DEVD⁃CHO 15 μmol/L），并以正常培养的HK⁃2细胞为空白对照组。
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1.2.2 Western blot检测
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提取细胞总蛋白，用蛋白标准品绘制标准曲线进行蛋白定量。80V恒压电泳30min后，继续用120V恒压电泳至蛋白Marker跑至距离胶底1cm，停止电泳。用硝酸纤维素薄膜90V恒压下电转2h。将蛋白膜用封闭液（含5%脱脂奶粉）室温封闭2h，再浸入用封闭液按1∶500稀释的一抗溶液中，4℃过夜；将蛋白膜用TBST洗涤3次，5min/次后，再浸入用TBST按1∶1 000稀释的二抗溶液中，室温孵育1h。洗膜后，用显影剂显色，用自动凝胶成像系统记录并分析Cleaved⁃Caspase3和Cleaved⁃ PARP蛋白条带。
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1.2.3 ROS检测
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将各组细胞制成1×105 个/mL单细胞悬液，按100 μL/孔加入流式管中，加入5 μmol/L DHE，37℃ 避光孵育30min，PBS洗涤后，上流式细胞仪检测。
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1.2.4 细胞增殖检测
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将细胞按1×103 个/孔接种到96孔板，给予相应处理，每组设6个平行孔。分别在处理后的0h和48h，每孔加入20 μL MTT溶液，置培养箱中孵育4h。用酶标仪检测各孔在490nm处的吸光度，计算细胞存活率，以时间为横坐标，存活率为纵坐标，绘制细胞增殖曲线。
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1.2.5 细胞凋亡检测
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将各组细胞用胰酶消化后，用PBS缓冲液制成1×105 个/mL单细胞悬液，按100 μL/孔加入流式管中，再分别加入20 μL Annexin V⁃异硫氰酸（fluores⁃ cein isothiocyanate，FITC），和20 μL碘化丙啶（prop⁃ idium iodide，PI）。另设单阳管和阴性对照管，室温避光孵育20min；再加入500 μL PBS缓冲液，混匀后上流式细胞仪检测。
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1.2.6 细胞周期检测
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将各组细胞制成1×105 个/mL单细胞悬液，按100 μL/孔加入流式管中，加入1mL PBS和2mL无水乙醇，用封口膜密封管口置于4℃ 24h，固定细胞。吸出上清液，加3mL PBS重悬细胞，离心，向管底加入200 μL 50mg/mL的PI染液，4℃避光孵育30min，上流式细胞仪检测细胞周期。
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1.3 统计学方法
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用SPSS17.0软件进行数据处理，结果用均数± 标准差（ ± s）表示，两组间比较采用t检验；多组间比较用单因素方差分析（one⁃way ANOVA），组间两两比较采用LSD法。以 P< 0.05为差异有统计学意义。
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2 结果
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2.1 H2O2引起脓毒症肾小管上皮细胞凋亡相关蛋白的异常表达
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H2O2组肾小管上皮细胞Cleaved ⁃Caspase3和Cleaved ⁃ PARP蛋白表达较阴性对照组显著升高 （P< 0.05）；两组Cleaved⁃Caspase3和Cleaved⁃PARP蛋白均高于空白对照组（P< 0.05，图1）。结果表明，H2O2能引起脓毒症肾小管上皮细胞凋亡相关蛋白异常表达。
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图1 各组凋亡相关蛋白的表达
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Fig.1 Expression of apoptosis⁃related proteins in each group
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2.2 Caspase抑制剂降低氧化应激诱导的脓毒症肾小管上皮细胞ROS水平
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空白对照组、阴性对照组、H2O2组、Caspase抑制剂组和Caspase抑制剂+ H2O2 组细胞中ROS平均荧光强度分别为783±67、1 216±92、1 915±122、1 112±85和1 623±100。阴性对照组中ROS水平较空白对照组细胞升高（P< 0.05）；H2O2组ROS水平较阴性对照组进一步升高（P< 0.05），Caspase抑制剂+H2O2 组细胞中ROS水平较H2O2 组降低 （P< 0.05），但仍高于阴性对照组（P< 0.05，图2）。结果说明，H2O2能提高脓毒症肾小管上皮细胞的ROS水平，而Caspase抑制剂能降低H2O2 诱导的ROS水平升高效应。
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图2 各组细胞ROS水平检测
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Fig.2 Detection of ROS levels in each group
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2.3 Caspase抑制剂削弱氧化应激对脓毒症肾小管上皮细胞增殖的抑制作用
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空白对照组、阴性对照组、H2O2组、Caspase抑制剂组和Caspase抑制剂+ H2O2组细胞增殖率分别为（179.21 ± 9.00）%、（153.57 ± 7.40）%、（120.20 ± 6.24）%、（159.21±8.25）%和（143.21±5.33）%。阴性对照组细胞增殖率低于空白对照组（P< 0.05）， H2O2组细胞增殖率低于阴性对照组（P< 0.05），说明H2O2诱导的氧化应激能抑制脓毒症肾小管上皮细胞增殖。Caspase抑制剂+ H2O2组细胞增殖率较H2O2组升高（P< 0.05），但仍低于阴性对照组（P< 0.05，图3），说明Caspase抑制剂能部分逆转氧化应激对细胞增殖的抑制效应。
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2.4 Caspase抑制剂抑制氧化应激诱导的脓毒症肾小管上皮细胞凋亡
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由图4可见，空白对照组、阴性对照组、H2O2组、Caspase抑制剂组和Caspase抑制剂+H2O2组的细胞凋亡率分别为（3.18 ± 0.43）%、（6.25 ± 0.40）%、 （11.75±1.61）%、（5.01±0.78）%和（9.97±0.47）%。阴性对照组细胞凋亡率较空白对照组升高（P< 0.05），H2O2组细胞凋亡率较阴性对照组升高（P< 0.05）。Caspase抑制剂+H2O2组细胞凋亡率较H2O2 组降低（P< 0.05），仍高于阴性对照组（P< 0.05）。 H2O2 组细胞中Cleaved⁃Caspase3和Cleaved⁃PARP蛋白表达较阴性对照组升高（P< 0.05），Caspase抑制剂 + H2O2 组细胞中Cleaved ⁃ Caspase3和Cleaved⁃PARP蛋白表达较H2O2组降低（P< 0.05，图5）。结果显示，H2O2能诱导脓毒症肾小管上皮细胞凋亡，而Caspase抑制剂能抑制H2O2诱导的细胞凋亡。
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图3 各组细胞增殖水平检测
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Fig.3 Detection of cell proliferation in each group
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图4 各组细胞凋亡检测
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Fig.4 Detection of cell apoptosis in each group
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2.5 Caspase抑制剂削弱氧化应激对脓毒症肾小管上皮细胞周期的阻滞
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由图6可见，空白对照组处于G1期、G2期和S期的细胞分别占（21.50±2.10）%、（32.63±2.76）%和 （45.87±4.59）%。阴性对照组处于G1期、G2期和S期的细胞分别占（26.50±2.01）%、（27.63±3.34）%和 （45.87±4.23）%。H2O2组处于G1期、G2期和S期的细胞分别占（37.23 ± 3.67）%、（15.39 ± 2.10）%和 （47.38±5.32）%。Caspase抑制剂组处于G1期、G2期和S期的细胞分别占（28.67±3.87）%、（27.12 ± 2.98）%和（44.20±5.10）%。Caspase抑制剂+H2O2组处于G1期、G2期和S期的细胞分别占（30.22 ± 3.45）%、（21.01±3.44）%和（48.77±3.78）%。各组S期细胞比例无显著差异（P> 0.05）。阴性对照组G1期细胞比例高于空白对照组（P< 0.05），H2O2组细胞G1期比例高于阴性对照组（P< 0.05），说明H2O2诱导的氧化应激能引起脓毒症细胞周期紊乱，发生G1期阻滞。Caspase抑制剂+H2O2组细胞G1期比例低于H2O2组（P< 0.05），说明Caspase抑制剂能逆转H2O2对细胞周期G1期的阻滞作用，促进周期进展。
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3 讨论
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脓毒症是宿主在应对感染时反应失调而引起的一种器官功能障碍综合征，临床上50%的脓毒症患者均有不同程度的肾损害，并且与脓毒症的2年死亡率密切相关[10，11]。大多数脓毒症患者死于多器官衰竭，AKI是最常见的并发症之一，是脓毒症患者死亡的独立危险因素[2]，寻找脓毒症急性肾损伤的特异性标志物和有效的防治策略刻不容缓。
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图5 各组凋亡相关蛋白的表达
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Fig.5 Expression of apoptosis⁃related proteins in each group of spesis
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图6 各组细胞G1期比例
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Fig.6 Proportion of G1phase cells in each group
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氧化应激损伤是脓毒症组织器官损伤的重要机制，且氧化应激和脓毒症全身和局部持续性炎症反应之间存在密切关联。病原体及其释放的毒素激活炎症反应及宿主释放炎症介质会影响氧化呼吸链的偶联过程，引起线粒体损伤和功能障碍，最终导致组织、器官损伤。脓毒症大鼠肺组织超氧化物歧化酶（superoxide dismutase，SOD）活性降低，诱导型一氧化氮合酶（inducible nitric oxide synthase， iNOS）活性升高[12]。产生的大量iNOS源性一氧化氮对心肌细胞也有毒性作用，能抑制心肌产生ATP，引起心肌收缩障碍，最终导致脓毒症心力衰竭[13]。氧化应激也会对肾组织造成损伤，线粒体是肾实质细胞ROS的主要产生部位[14]。生理条件下，肾实质细胞中的ROS维持在较低水平，对肾小管和肾微循环的生理调节有作用[15]；脓毒症时，在各种炎症因子的刺激下，肾小管和肾血管中ROS生成增强，同时谷胱甘肽（glutathione，GSH）等抗氧化物减少， ROS攻击肾小管细胞导致膜损伤及线粒体超氧阴离子渗漏，随着细胞中ROS浓度的进一步增加，最终引起脓毒症肾损伤[16]。以氧化应激损伤为靶点的治疗已经成为近年来脓毒症的研究热点。本研究发现，用LPS刺激肾小管上皮细胞后，细胞ROS水平明显较正常肾小管上皮细胞升高，提示脓毒症时肾小管细胞的氧化应激水平较生理状态异常升高。本研究用H2O2处理细胞，ROS检测显示H2O2引起了细胞更高水平的氧化应激损伤，结果显示，与未经H2O2处理的脓毒症细胞模型相比，H2O2组细胞的增殖率降低，凋亡率升高，同时发生了细胞周期的G1期阻滞。结合文献报告和本研究结果，我们更倾向于认为ROS对脓毒症肾小管上皮细胞有抑制增殖和周期进展，诱导凋亡的作用，这与文献中以缓解氧化应激作为脓毒症肾损伤治疗的理论依据相吻合。
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Caspase是一类半胱氨酸天冬氨酸特异性蛋白酶，存在于胞质中，线粒体途径细胞凋亡的本质是Caspase依赖的蛋白酶级联反应[17]。本研究重点关注的正是ROS与线粒体途径的细胞凋亡。有研究发现，肿瘤细胞高表达Caspase⁃3/7，能破坏线粒体膜电位和上调ROS水平，诱导细胞凋亡，ROS抑制剂能逆转这种效应[18]。原代大鼠软骨细胞中过高水平的ROS能引起细胞色素c和Caspase⁃3高表达，促进细胞凋亡[19]。本研究用Caspase抑制剂Ac ⁃ DEVD⁃CHO联合H2O2处理脓毒症肾小管上皮细胞模型，结果发现，细胞ROS水平较H2O2组降低，但仍高于阴性对照组，说明H2O2诱导的氧化应激在一定程度上具有Caspase依赖性，抑制Caspase能部分减弱脓毒症肾小管上皮的氧化应激损伤。细胞的相关生物学行为检测显示，Caspase抑制剂联合H2O2处理的脓毒症肾小管上皮细胞增殖率较H2O2组升高，凋亡率降低，细胞周期处于G1期的比例减少，说明氧化应激损伤对脓毒症肾小管细胞增殖、凋亡和细胞周期的作用具有Caspase依赖性，抑制Caspase能逆转氧化应激损伤对脓毒症肾小管细胞的抑制增殖、促进凋亡和引起细胞周期G1期阻滞的效应。但是，Caspase抑制剂联合H2O2处理组的细胞增殖、凋亡和G1期细胞周期所占比例仍和阴性对照组有差异，说明抑制Caspase只能部分影响氧化应激对脓毒症肾小管上皮的作用，提示氧化应激可能还通过其他途径对脓毒症肾小管上皮细胞造成损伤。 Kaleem等[20] 研究显示Caspase释放的功能受O2-调节，这与本研究结果相吻合。
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综合以上实验结果，认为ROS造成的脓毒症肾小管上皮细胞增殖抑制、凋亡增加和细胞周期G1期阻滞效应，部分是通过线粒体⁃Caspase途径实现的。通过直接降低ROS水平或阻断线粒体⁃Caspase凋亡途径，都能对脓毒症时肾小管上皮细胞中异常升高的氧化应激水平产生抑制作用，并通过促进细胞的增殖和周期进展，减少细胞凋亡坏死，对肾小管上皮损伤起保护作用。但是除了线粒体⁃Caspase途径，其他细胞凋亡通路是否也在脓毒症肾小管损伤中发挥作用，目前尚不清楚，未来还需要更多的实验进行探讨。
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摘要
目的：观察不同活性氧（reactive oxygen species，ROS）及氧化应激水平对脓毒症肾小管上皮细胞增殖、凋亡、周期等生物学效应的影响，探索氧化应激水平和线粒体⁃Caspase途径能否作为脓毒症肾小管上皮损伤的治疗靶点。方法：用终浓度为10 μg/mL的脂多糖（lipopolysaccharide，LPS）处理人肾小管上皮HK⁃2 细胞 12 h建立脓毒症细胞模型，将细胞模型随机分为 H2O2组（H2O2，300 μmol/L）、Caspase 抑制剂组（Ac⁃DEVD⁃CHO，15 μmol/L）、Caspase抑制剂+H2O2组（H2O2，300 μmol/L+Ac⁃DEVD⁃ CHO，15 μmol/L）和阴性对照组（不处理）；另以正常培养的HK⁃2细胞为空白对照组。Western blot 检测Cleaved⁃Caspase3 和 Cleaved⁃多聚ADP核糖多聚酶（poly ADP⁃ribose polymerase，PARP）蛋白表达，MTT 检测细胞增殖，流式细胞术检测细胞 ROS水平、细胞凋亡和细胞周期。结果：阴性对照组细胞ROS水平、凋亡率、凋亡相关蛋白Cleaved⁃Caspase3和Cleaved⁃PARP水平以及G1期细胞比例均较空白对照组升高（P均 < 0.05），增殖率较空白对照组降低（P < 0.05）。H2O2组细胞ROS水平、凋亡率、 Cleaved⁃Caspase3和Cleaved⁃PARP水平以及G1期细胞比例均较阴性对照组升高（P均 < 0.05），而增殖率较阴性对照组降低 （P < 0.05）。Caspase抑制剂+H2O2组细胞ROS 水平、凋亡率、Cleaved⁃Caspase3和 Cleaved⁃PARP水平以及G1期细胞比例均较 H2O2组降低（P均 < 0.05），但均高于阴性对照组（P均 < 0.05））；增殖率较H2O2组升高（P <0.05），但仍低于阴性对照组（P < 0.05）。结论：脓毒症细胞模型中存在异常升高的氧化应激反应。ROS能通过线粒体⁃Caspase凋亡途径抑制脓毒症肾小管上皮细胞增殖，促进细胞凋亡和引起细胞周期G1期阻滞。抑制Caspase对ROS引起的脓毒症肾小管上皮细胞损伤有一定保护作用。
Abstract
Objective：To observe the effects of different levels of reactive oxygen species（ROS）and oxidative stress on cell proliferation，apoptosis，cycle in the renal tubular epithelial model of sepsis，and to explore whether oxidative stress and mitochondrial⁃ Caspase pathway can be used as the therapeutic target of sepsis renal tubular epithelial injury. Methods：Human renal tubular epithelial HK⁃2 cells were treated with lipopolysaccharide（LPS）at a final concentration of 10 μg/mL for 12 h to establish a sepsis cell model. The sepsis cell model was randomly divided into H2O2 group（H2O2，300 μmol/L），Caspase inhibitor group（Ac⁃DEVD⁃CHO， 15 μmol/L），Caspase inhibitor+H2O2 group（H2O2，300 μmol/L+Ac⁃DEVD⁃CHO，15 μmol/L）and negative control group（no treatment）. Normal cultured HK⁃2 cells were taken as the blank control group. the expression of Cleaved⁃Caspase⁃3 and Cleaved⁃poly ADP⁃ribose polymerase（PARP）protein were detected by Western blot，cell proliferation was detected by MTT，cell ROS levels，apoptosis and cell cycle were detected by flow cytometr. Results：The ROS，apoptosis rate，Cleaved⁃Caspase3 and Cleaved⁃PARP level，the proportion of G1 cells in negative control group were all higher than those in blank control group（all P <0.05），the proliferation rate was lower than that of blank control group（P < 0.05）. The ROS，apoptosis rate，Cleaved⁃Caspase3 and Cleaved⁃PARP level，the proportion of G1 cells in H2O2 group were all higher than those of negative control group（all P <0.05），the proliferation rate was lower than that of negative control group（P <0.05）. The ROS，apoptosis rate，Cleaved⁃Caspase3 and Cleaved⁃PARP levels，the proportion of G1 cells in Caspase inhibitor+H2O2 group were all lower than those of H2O2 group（all P < 0.05），but were all higher than negative control group（P < 0.05）， the proliferation rate was higher than that of H2O2 group（P < 0.05），but still lower than that of negative control group（P < 0.05）. Conclusion：The oxidative stress level of sepsis cell model is abnormally upregulated. Excessive ROS can inhibit the proliferation of septic renal tubular epithelial cells，promote cell apoptosis and cause cell cycle G1 block through the mitochondrial⁃Caspase pathway. Inhibition of Caspase has a certain protective effect on renal tubular epithelial cell injury in sepsis caused by ROS.
Keywords
sepsis ； kidney injury ； oxidative stress ； mitochondria ； apoptosis