世界卫生组织报道，自1975年以来，全球肥胖人数几乎增加了两倍，现共有6 000万5岁以下儿童患上肥胖症，肥胖已成为一个严重的公共健康问题^[1]。肥胖以脂肪大量堆积为特征，并可导致多种代谢紊乱相关疾病的发生，如2型糖尿病、非酒精性脂肪肝和心血管疾病^[2-3]。脂肪组织不仅是储能器官，为人体的生命活动提供能量，也是人体重要的内分泌器官，可分泌多种细胞因子，具有重要生理功能^[4-5]。然而，由于能量摄入与消耗的不平衡，大量能量以甘油三酯的形式储存，脂肪组织迅速膨胀，脂肪组织的扩张将导致炎性细胞因子分泌增加，并减少瘦素和脂联素等抗炎蛋白的分泌，从而导致代谢紊乱^[6-7]。因此，深入研究脂肪组织的生成代谢对降低肥胖发生率具有重要意义。

脂肪生成是一个复杂的过程，与多种转录因子的动态表达有关。前体脂肪细胞的增殖和分化增加成熟脂肪细胞的数量，促进了甘油三酯的储存、代谢，并产生脂肪因子^[8]。微小核糖核酸（microRNA， miRNA）是一类内源性非编码单链RNA（18~24核苷酸），通过与靶mRNA的3′非翻译区（3′UTR）特异性结合，在转录后水平负调控基因表达^[9]。一些研究表明，miRNA可能和脂肪细胞的分化增殖发生相关。例如，Chen等^[10] 发现miR⁃146b是人内脏前脂肪细胞增殖和分化的调节因子，其表达在人体内发生改变。miR⁃130b可以靶向过氧化物酶体增殖物活化受体γ（peroxisome proliferator activated receptor γ， PPARγ）抑制猪脂肪沉积^[11]。既往研究发现miR⁃ 484在肥胖妇女或儿童的脂肪组织中差异表达^[9，12]，同时其表达与组织缺血再灌注损伤^[13]、宫颈癌肿瘤发生^[14]、肝硬化^[15] 等有关。然而，miR⁃484在肥胖中的作用仍不清楚。本研究通过在人前体脂肪细胞（human preadipocytes，HPA）中过表达及沉默miR⁃484，研究其对HPA细胞增殖及成脂分化的影响，在细胞层面揭示miR⁃484对肥胖的作用，并探讨了其下游作用的可能靶基因，以期为肥胖的防治提供一个新靶点。

1 材料和方法

1.1 材料

PBS、DMEM高糖培养基、DMEM培养基、胎牛血清、青霉素/链霉素（P/S）、0.25%胰蛋白酶（Gibco公司，美国）；含5%胎牛血清的人脂肪细胞培养基 （PAM，Science Cell公司，美国）；3⁃异丁基⁃1⁃甲基黄嘌呤（MIX）、地塞米松、胰岛素、罗格列酮、油红O染液（Sigma公司，美国）；miR⁃484、MAPK8、Cyclin D1、 Cyclin D3、CDK4、PPAR γ、CCAAT增强子结合蛋白 （CCAAT enhancer binding protein，C/EBP）⁃α、脂肪酸结合蛋白4（fatty acid binding protein 4，FABP4）、 β⁃actin及U6引物（广州锐博生物技术有限公司）； miR⁃484mimic、miR⁃484mimic NC、miR⁃484inhibi⁃ tor、miR⁃484inhibitor NC、MAPK8过表达质粒及其阴性对照（吉满生物科技上海有限公司）；TRIzol（In⁃ vitrogen公司，美国）；逆转录试剂盒、实时荧光定量PCR试剂盒、SYBR Green Master Mix（TaKaRa公司，日本）；甘油三酯测定试剂盒（北京普利莱基因技术有限公司）；二甲基亚砜（DMSO）（Sigma公司，美国）；兔抗人抗体MAPK8、β⁃actin（Abcam公司，英国）；羊抗兔IgG、CCK⁃8检测试剂盒（Cell CountingKit⁃8，上海碧云天生物技术研究所）；Lipofectamine3000（Invitrogen公司，美国）。Real⁃time PCR仪（型号：ViiA7）（UVP公司，美国），紫外分光光度计（上海美谱达仪器有限公司）。

1.2 方法

1.2.1 细胞培养与质粒转染

培养板中按1×10⁵ 个/mL接种HPA（Science Cell公司，美国），在37℃、5%CO₂孵箱中，以含5%胎牛血清的人脂肪细胞培养基培养，每2d换液1次，待细胞贴壁生长至完全融合并接触抑制2d后（第0天）开始诱导分化。具体步骤为：培养基换用DMEM高糖培养基，其中含0.5mmol/L MIX、1 μmol/L地塞米松、 5 μg/mL胰岛素和1 μmol/L罗格列酮，培养4d。随后分化培养基中撤去MIX、地塞米松、罗格列酮，使DMEM高糖培养基中只含有5 μg/mL胰岛素。后每3d换液1次，直至第15天，约85%以上的细胞已分化为成熟人脂肪细胞。为了评价miR⁃484对HPA增殖和分化的影响，采用Lipofectamine3000对细胞转染miR ⁃484mimic、miR ⁃484inhibitor、MAPK8过表达质粒及其阴性对照。

1.2.2 CCK⁃8实验

为了研究HPA的增殖能力，使用CCK⁃8检测试剂盒在0h、24h、48h这3个不同的时间点进行检测。使用10 μL CCK⁃8溶液处理接种在96孔板中 （5×10³ 个/mL）的脂肪细胞，孵育细胞2h后，使用分光光度仪测定其450nm处吸光度值。

1.2.3 油红O染色

油红O染色在室温下进行，取诱导分化成熟的人脂肪细胞（第15天），用PBS洗涤细胞3次，后在10%多聚甲醛中固定1h，吸取出固定液后晾干。油红O溶解于异丙醇中，配成3mg/mL的染液并过滤，随后加入晾干的细胞中染色1h。最后，用PBS轻轻洗涤细胞，倒置显微镜观察，镜下脂滴应成亮红色。

1.2.4 细胞甘油三酯含量测定

细胞接种于6孔板中，取分化成熟的人脂肪细胞（第15天），PBS轻柔洗涤细胞1次后用胰酶消化细胞，收集细胞于离心管中，根据甘油三酯测定试剂盒说明书，加入100 μL裂解液，室温裂解10min，留取20 μL裂解液进行BCA法蛋白定量，70 μL裂解液70℃加热10min后离心取上清，使用分光光度仪在510nm处测量细胞裂解物中甘油三酯的含量，测定结果用总蛋白浓度校准。

1.2.5 靶基因测定与验证

利用在线数据库Targetscan7.2（http：//www.tar⁃getscan.org/vert_72/）对miR⁃484的靶基因及潜在的结合位点进行了预测。使用DAVID 6.7在线数据库 （https：//david.ncifcrf.gov/）进行基因本体（Gene On⁃ tology，GO）分析、KEGG（Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes）富集分析。为了验证结合位点，构建了荧光素酶报告质粒MAPK8的野生型和突变型。将293T细胞接种到24孔板中，以含10%胎牛血清的DMEM培养基培养。当细胞密度达到70%时，将野生型或突变型质粒与miR⁃484mimic及miR⁃484mimic NC共转染到293T细胞中。24h后使用双荧光素酶报告分析试剂盒测量荧光素酶活性。

1.2.6 RT⁃qPCR检测

使用TRIzol法提取细胞的总RNA，使用TaKaRa反转录试剂盒进行mRNA和miRNA的逆转录，用SYBR Premix Ex Taq试剂盒（TaKaRa）进行定量实时聚合酶链反应。使用2^-ΔΔCT法计算mRNA和miRNA的相对表达水平。β⁃actin用作mRNA的内部标准化对照，U6用作miRNA的内部标准化对照。qRT⁃PCR检测中使用的引物序列见表1。

1.2.7 Western blot实验

用RIPA法提取细胞蛋白，BCA法测定蛋白浓度后加入上样缓冲液，将蛋白样品的浓度定为20ng/mL，在100℃金属浴煮沸10min变性。采用10%SDS/PAGE凝胶和聚偏氟乙烯膜分离及转移蛋白，将膜在室温下用5%牛奶封闭1h后，与适当稀释的特异性抗体（MAPK8、β⁃actin）一起4℃孵育过夜，TBST洗涤膜3次，然后加入二抗，在摇床中孵育1h。最后用超敏ECL化学发光试剂检测曝光蛋白条带。

1.3 统计学方法

采用SPSS 23.0软件进行统计分析。定量资料以均数±标准差（$\stackrel{-}{x}\pm s$）表示，3组独立样本之间的差异采用重复测量方差分析检验，当3组独立样本间的差异有统计学意义时，SNK法进行组间两两比较。采用Graphpad Prism绘制直条图、复式直条图、线图等。P ＜0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 miR⁃484 在HPA分化过程中的表达及其过表达验证

为了验证HPA分化过程中miR⁃484的表达情况，分别取分化第0天、第4天、第8天、第15天的细胞，使用RT⁃qPCR技术检测，结果与未分化的细胞 （第0天）相比，随着分化的进行，miR⁃484表达量逐渐降低（P< 0.05），表明miR⁃484可能参与HPA的分化（图1A）。此外，为了验证miR⁃484过表达体系的建立，在HPA中转染了miR⁃484及其空白质粒，通过RT⁃qPCR发现miR⁃484表达较对照组及mimic NC组增高（P< 0.05，图1B）。

2.2 过表达miR⁃484抑制HPA增殖分化

为了进一步了解过表达miR⁃484对脂肪生成的作用，将miR⁃484mimic及miR⁃484mimic NC分别转染至HPA中。CCK⁃8实验检测转染后0h、24h及48h HPA的增殖能力，发现与对照组及mimic NC组相比，miR⁃484mimic组在24h及48h的吸光度值降低 （P< 0.05，图2A）。同时对细胞周期相关基因Cyclin D1、Cyclin D3和CDK4的mRNA相对表达量进行了检测，RT⁃qPCR实验发现miR⁃484mimic组的细胞周期相关基因表达量均减少（P< 0.05，图2B），由此可见，过表达miR⁃484可以抑制HPA的增殖。

为了研究miR⁃484对HPA成脂分化的影响，在HPA中过表达miR⁃484后，对分化第15天的成熟人脂肪细胞进行油红O染色，镜下观察发现，与对照组及mimic NC组相比，miR⁃484mimic组脂肪细胞脂滴数量及体积明显减少（图2C），也对脂肪分化相关基因PPAR γ、C/EBP α和FABP4的mRNA相对表达量进行了检测，RT⁃qPCR实验发现miR⁃484mimic组的脂肪分化相关基因表达量均减少（P< 0.05，图2D）。同时，甘油三酯定量测定发现与对照组及mimic NC组相比，miR⁃484mimic组的甘油三酯含量减少（P< 0.05，图2E）。这表明过表达miR⁃484可以抑制HPA向成熟脂肪细胞分化。

2.3 沉默miR⁃484促进HPA的增殖分化

为了进一步了解沉默miR⁃484对脂肪生成的作用，将miR⁃484inhibitor及miR⁃484inhibitor NC分别转染至HPA中。CCK⁃8实验检测转染后0h、24h及48h HPA的增殖能力发现，与对照组及inhibitor NC组相比，miR⁃484inhibitor组在24h及48h的吸光值升高（P< 0.05，图3A）。同时对细胞周期相关基因Cyclin D1、Cyclin D3和CDK4的mRNA相对表达量进行了检测，RT⁃qPCR实验发现miR⁃484inhibitor组的增殖相关基因表达量均升高（P< 0.05，图3B），由此可见，沉默miR⁃484可以促进HPA的增殖。

为了研究沉默miR⁃484对HPA成脂分化的影响，在脂肪细胞中沉默miR⁃484后，对分化第15天的成熟人脂肪细胞进行油红O染色，镜下观察发现，与对照组及inhibitor NC组相比，miR⁃484inhibitor组脂肪细胞脂滴数量及体积增加（图3C），也对脂肪分化相关基因PPAR γ、C/EBP α和FABP 4的mRNA相对表达量进行了检测，RT⁃qPCR实验发现miR⁃484inhibitor组的脂肪分化相关基因表达量均升高（P< 0.05，图3D）。同时甘油三酯定量测定发现与对照组及inhibitor NC组相比，miR⁃484inhibitor组的甘油三酯含量增加（图3E，P< 0.05）。这表明沉默miR⁃ 484可以促进HPA向成熟脂肪细胞分化。

2.4 miR⁃484靶向作用于MAPK8

miRNA可以与mRNA的3′UTR区结合沉默靶基因的表达，从而发挥重要的生物学功能。通过在线生物信息学分析预测发现，MAPK8可作为miR⁃484的靶基因（图4A）。为了进一步验证miR⁃484是否可与MAPK8的3′ UTR区结合，本研究构建了MAPK8的突变型（MAPK MUT）与野生型（MAPK WT）质粒，并进行了双荧光素酶报告基因分析，结果表明，与mimic NC组相比，miR ⁃ 484mimic与MAPK8WT共转组的相对荧光活性降低（图4B， P< 0.05），表明miR⁃484可与野生型MAPK8结合，由此可见，MAPK8可以与miR⁃484结合，可作为miR⁃484的靶基因。

2.5 miR⁃484抑制MAPK8的mRNA及其蛋白表达

为了进一步验证miR⁃48对其靶基因MAPK8的作用，本研究在脂肪细胞中过表达miR⁃484，qRT ⁃ PCR和蛋白免疫印迹检测结果显示，与对照组及mimic NC组相比，过表达miR ⁃484显著下调了脂肪细胞中MAPK8的mRNA和蛋白水平（ 图5，P< 0.05）。这表明miR⁃484可以抑制MAPK8的表达。

2.6 过表达MAPK8部分挽救miR⁃484对HPA增殖分化的抑制作用

为了进一步研究miR ⁃484是否确实通过其靶标MAPK8发挥功能，本研究将miR ⁃484mimic与MAPK8mimic质粒共转染进HPA细胞。通过CCK⁃8实验检测转染后0h、24h及48h HPA细胞的增殖能力发现，与miR ⁃484mimic相比，共转染组24h及48h吸光度升高（P< 0.05，图6A）。对细胞周期相关基因Cyclin D1、Cyclin D3和CDK4的mRNA相对表达量进行检测，发现MAPK8与miR ⁃484共转部分逆转了miR⁃484引起的相关基因表达量的下降（P< 0.05，图6B）。由此可见，MAPK8可以逆转miR⁃484抑制HPA细胞增殖的作用。对分化第15天的成熟人脂肪细胞进行油红O染色，镜下观察发现， MAPK8逆转了过表达miR⁃484引起的脂肪细胞脂滴数量及体积的减少（图6C），对脂肪分化相关基因PPAR γ、C/EBP α和FABP 4的mRNA相对表达量进行检测，发现MAPK8可以逆转miR⁃484引起的脂肪分化相关基因表达量的下降（P< 0.05，图6D）。甘油三酯定量测定，发现MAPK8逆转了过表达miR ⁃ 484引起的甘油三酯含量下降（图6E，P< 0.05）。这表明过表达MAPK8可以逆转miR⁃484抑制HPA增殖分化的作用。

3 讨论

miRNA是调节基因表达的非编码小RNA，在不同组织或器官中都发挥重要作用，它在脂肪组织中的主要功能是调节脂肪细胞的增殖、分化、代谢和内分泌^[16]。大量研究表明，肥胖与miRNA的失调密切相关，miRNA表达的改变可能导致控制一系列生物功能的基因表达模式的改变，包括炎症、胰岛素敏感性和脂肪生成^{[1 7]}。miR⁃484差异表达于肥胖人群，但是miR⁃484对脂肪细胞的生物学功能的影响尚不清楚。本研究发现miR⁃484在HPA分化过程中表达逐渐降低，暗示了miR⁃484可能与肥胖发生相关，同时也可能是脂肪分化与形成过程的重要靶点。

抑制脂肪组织的脂肪生成是肥胖发生过程中的一个中心事件，而脂肪细胞增殖和分化是脂肪组织中脂质积累的基础，可由多种因素调节^{[1 8]}。控制脂肪的分化及增殖可以抑制肥胖和肥胖相关疾病的发生。本研究表明miR⁃484与HPA细胞的增殖及细胞周期调节基因Cyclin D1、Cyclin D3和CDK4表达成负相关。细胞周期蛋白（Cyclin D1、Cyclin D3） 和细胞周期蛋白依赖性激酶（CDK4）被认为是真核生物中细胞生长和增殖的关键调节因子，这是哺乳动物细胞中G1/S和G2/M转变所必需的。Liu等^{[1 9]} 研究表明miR ⁃484通过靶向CCL ⁃18抑制胃癌细胞的增殖。Xie等^[20] 发现lncRNA ZFAS1通过沉默miR⁃ 484来促进结肠癌细胞的增殖。这些研究与本研究结果相一致。同时，本研究也发现miR⁃484与脂肪分化基因PPARγ、C/EBPα和FABP4表达呈负相关。PPARγ和C/EBPα是脂肪分化过程中发挥核心作用的转录因子，FABP4促进脂肪酸增溶、运输和新陈代谢。本研究进一步对HPA进行了油红O染色和甘油三酯检测，发现miR⁃484与脂滴生成负相关。因此认为miR⁃484可以调控脂肪细胞的分化和增殖。

本研究中也对miR⁃484抑制HPA增殖与分化的机制进行了探讨。miRNA是内源性小RNA，通过与蛋白质编码基因的mRNA配对来指导其转录后抑制，从而发挥重要的基因调节作用。通过在线生信分析发现MAPK8可能是miR⁃484的靶基因，并通过双荧光素酶报告实验确认了miR⁃484与MAPK8具有相应的结合位点，同时过表达miR⁃484可以抑制MAPK8的表达。MAPK8是蛋白丝裂激酶家族的成员，充当多种生物化学信号的集成点，如胰岛素信号通路，并且涉及各种细胞过程，例如增殖、分化、转录调控和发育^[21-22]。Osawa等^[23] 发现MAPK8与胰岛素抵抗相关，MAPK8活性在肥胖的胰岛素抵抗小鼠中增加，而敲除MAPK8的小鼠显示肥胖减少和胰岛素敏感性提高。本研究过表达MAPK8，发现其可以逆转过表达miR⁃484抑制HPA细胞增殖及分化的作用。结合既往研究及本研究结果，MAPK8可能是miR⁃484的靶基因。

综上所述，本研究发现miR⁃484在HPA分化过程中低表达，并通过进一步的功能实验，证实了miR⁃484抑制HPA的增殖与分化，该作用可能是通过靶向MAPK8来实现。本研究也存在一些缺点，例如miR⁃484预测的相关靶基因较多，我们只关注了MAPK8，因为其属于胰岛素信号通路，且相关研究表明其与肥胖相关，后期仍需采取转录组学等手段进一步研究相关机制。因此，本研究结果提示miR⁃484在肥胖中发挥关键作用，miR⁃484可能是肥胖诊断与治疗的一个靶点。

参考文献