气道重塑是支气管哮喘（简称哮喘）发生发展的重要事件，包括一系列关键环节，如上皮间充质转化（epithelial⁃mesenchymal transition，EMT）、成纤维细胞活化及分化为肌成纤维细胞、细胞外基质（extracellular matrix，ECM）沉积等^[1-2]。随着EMT机制的不断探索，其与气道疾病、尤其与哮喘的相关性已倍受关注。新近研究证实，EMT在上皮异常修复、纤维生成等过程中扮演了重要角色^[3-4]。人支气管上皮细胞（human bronchial epithelial cell，HBE）作为机体接触外界的第一道防线，应激后发生EMT，同时产生多种促纤维化因子如转化生长因子⁃β （transforming growth factor⁃β，TGF⁃β）等加速EMT进程^[5]。EMT时，HBE历经细胞间连接丢失等一系列改变，启动整个气道重塑过程。然而，哪些因素参与调控EMT及其具体机制目前仍不明确。

蛋白酶激活受体2（protease ⁃activated receptor 2，PAR2）作为独特的PAR家族成员，在呼吸系统 （如支气管上皮、成纤维、内皮细胞等）广泛表达^[6]，且参与多种呼吸系统疾病体内稳态的调节。作为细胞表面的“传感器”，PAR2主要介导细胞对胞外丝氨酸蛋白酶的应答。其天然配体——类胰蛋白酶（是机体内PAR2的天然激动剂，主要源于肥大细胞，被认为是哮喘中的一种重要炎症介质），通过裂解PAR2胞外段、激活受体^[7]，在哮喘、COPD、肺纤维化等慢性呼吸系统疾病中对成纤维细胞的增殖具有促进作用^[8]。急性肺损伤中，激活PAR2不仅可引起成纤维细胞增殖^[9]，还可导致内皮屏障功能障碍、血管通透性增加^[10]，可见肺组织中PAR2对多种细胞的功能具有调控作用。然而，PAR2对气道重要结构细胞HBE的功能、尤其是其EMT表型转化过程是否存在影响，迄今尚未见报道。

机体多种病理生理过程中，活性氧（reactive ox⁃ ygen species，ROS）是一类重要的信号分子^[11]。研究发现，ROS生成与PAR2活化密切相关^[12]。本研究通过体外培养HBE、建立TGF⁃β诱导的EMT模型，着重观察PAR2活化对HBE细胞EMT的影响、并阐明ROS信号在该过程中的作用。

1 材料和方法

1.1 材料

类胰蛋白酶（T7063）、ROS检测试剂盒（reactive oxygen species，DCFH⁃DA）（MAK143，Sigma⁃Aldrich公司，美国）。ROS清除剂N⁃乙酰半胱氨酸（N⁃acety ⁃1⁃cysteine，NAC）（616⁃91⁃1，中国国药集团）。PAR2抑制剂FSLLRY⁃NH2（FS）（C7865BL120⁃1，南京金斯瑞公司）。TGF⁃β1（7754⁃BH，R&D system公司，美国）。抗α⁃平滑肌肌动蛋白（α⁃smooth muscle ac⁃tin，α⁃SMA）（ab5694）、N⁃cadherin（ab76011）、E⁃cad⁃ herin（ab40772）特异性抗体（Abcam公司，英国）。抗甘油醛⁃3⁃磷酸脱氢酶（glyceraldehyde⁃3⁃phosphate dehydrogenase，GAPDH）特异性抗体（2118，CST公司，美国）。辣根过氧化物酶标记的山羊抗兔IgG抗体（sc⁃2004，Santa Cruz公司，美国）。

1.2 方法

1.2.1 细胞培养

人支气管上皮细胞系16HBE购自北京癌症研究所，培养于RPMI 1640培养基（Invitrogen Gibco公司，美国）、1%青霉素/链霉素（Invitrogen Gibco公司，美国）及10%胎牛血清（fetal bovine serum， FBS，Invitrogen Gibco公司，美国）配制的完全培养基，置于37℃、5%CO₂条件的细胞培养箱孵育，每隔2~3d更换培养基，直至细胞密度达80%后，0.5%胰酶（Invitrogen Gibco公司，美国）消化、传代。

1.2.2 划痕实验

划痕实验检测16HBE修复迁移功能。16HBE接种于6孔板，培养24h后以无血清培养基饥饿6~8h；使用200 μL无菌移液枪头尖端在细胞上进行一次笔直划痕，PBS清洗漂浮的细胞；每孔加入含不同浓度类胰蛋白酶、NAC、TGF⁃β的无血清培养基，立即显微镜拍照；培养箱孵育24h后，再次记录划痕区域。使用Image J软件计算迁移平均距离，重复3次实验进行统计学分析。

1.2.3 迁移实验

Transwell小室迁移实验检测16HBE迁移功能。完全培养基中培养16HBE至密度80%后，无血清培养基饥饿；细胞计数后以100 μL细胞悬液 （2.0×10⁴ 个/孔）接种于Transwell（Corning公司，美国）上室，置于24孔板中；加入含不同浓度的类胰蛋白酶、NAC、TGF⁃β的完全培养基于下室，细胞培养箱中孵育24h；弃培养基、PBS清洗，多聚甲醛固定30min后，棉签擦拭小室细胞，结晶紫孵育5min； PBS清洗3次后，显微镜拍照。随机取4个不同视野计数，并行统计学分析。

1.2.4 蛋白质免疫印迹实验

蛋白质免疫印迹实验检测16HBE中α⁃SMA、E⁃ cadherin、N⁃cadherin蛋白表达量。用不同浓度类胰蛋白酶刺激16HBE 48h后收集细胞、PBS洗涤2次，200 μL RIPA冰上裂解15min；收集裂解物， 14 000r/min离心20min，十二烷基硫酸钠（sodium dodecyl sulfate，SDS）蛋白变性；制胶上样，80~120V恒压电泳，300mA恒流PVDF转膜；Tween 20的Tris洗涤缓冲液（TBST）配制5%脱脂奶粉溶液，37℃封闭1h；加入抗α⁃SMA（1∶100）、E⁃cadherin（1∶1 000）、 N⁃cadherin（1∶1 000）、GAPDH（1∶1 000）抗体4℃孵育过夜；TBST洗涤后，与辣根过氧化物酶标记的山羊抗兔IgG抗体孵育；ECL化学发光液（Thermo公司，美国）曝光，并用Bio⁃Rad Gel Doc/Chemi Doc成像系统及Quantity One软件进行分析。

1.2.5 ROS测定

DCFH⁃DA探针检测16HBE胞内ROS。细胞内ROS可与DCFH反应生成DCF的荧光产物。本研究中，10mmol/L DCFH⁃DA溶于无血清培养基中，稀释1 000倍得到10 μmol/L工作液；将密度达80%的16HBE接种于6孔板中，实验组试剂处理6h；37℃ DCFH⁃DA探针避光作用30min，PBS洗涤2次，激光扫描共聚焦显微镜（LSM 5LIVE，Zeiss公司，德国） 调节为FL1Log通道，525nm波长，观察细胞并拍照。随机取4个不同视野行统计学分析。

1.3 统计学方法

使用Graphpad 6.0和SPSS 20统计软件进行分析处理，计量资料以均值±标准差（$\stackrel{-}{x}\pm s$）表示，单因素方差分析比较多组间差异。P ＜0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 类胰蛋白酶促HBE细胞修复与迁移

上皮细胞发生EMT时，修复、迁移功能增强。本研究结果显示，对照组HBE细胞形态呈典型的鹅卵石样特征，修复、迁移功能较弱（图1）；然而给予不同浓度（1、10、50、100pmol/L）类胰蛋白酶作用后，细胞呈现纺锤形，修复、迁移功能明显增强（图1）。当浓度≥50pmol/L时，类胰蛋白酶可显著上调细胞的修复、迁移能力（P< 0.05，图1）；浓度达100pmol/L时，细胞修复、迁移能力与TGF⁃β阳性对照组（10ng/mL）相近（图1）。

2.2 类胰蛋白酶下调HBE细胞E⁃cadherin、上调N⁃ cadherin及α⁃SMA蛋白表达

EMT过程中，往往伴随上皮、间充质细胞特征标志物水平的变化。蛋白印迹结果显示，不同浓度类胰蛋白酶处理16HBE后，间充质细胞标志物 （N⁃cadherin及α⁃SMA）表达上调，上皮细胞标志物 （E ⁃cadherin）表达降低（P< 0.05，图2）。故选择100pmol/L浓度进行后续研究。

2.3 类胰蛋白酶上调HBE细胞ROS的水平

既往肺纤维化研究提示，ROS是疾病进展的重要信号，胞内ROS水平与EMT诱导密切相关。本研究采用DCFH⁃DA探针结合荧光显微镜观察ROS水平变化，结果显示与对照组相比，100pmol/L类胰蛋白酶显著上调了HBE细胞ROS的水平，其效应与TGF ⁃β相近（P< 0.05，图3）。200 μmol/L浓度的PAR2阻断剂FS，可有效阻断类胰蛋白酶的促ROS生成效应（P< 0.05，图3）。

2.4 ROS介导类胰蛋白酶促HBE细胞修复、迁移效应

为了探讨类胰蛋白酶引起的上皮细胞ROS水平上调是否是诱导EMT过程的重要信号，应用ROS强效清除剂NAC处理细胞，观察类胰蛋白酶的促HBE细胞修复、迁移效应是否被抑制。如图4显示，与类胰蛋白酶单处理组相比，同时给予2mmol/L NAC下调ROS水平，可显著抑制16HBE细胞的修复及迁移（P< 0.05），提示ROS水平增高是类胰蛋白酶上调细胞修复与迁移的重要环节。

3 讨论

多种慢性疾病如器官纤维化、上皮源性肿瘤侵袭转移中，EMT是病程进展的关键环节，可引发后续一系列复杂的不良事件，包括细胞骨架重构， ECM沉积，肿瘤细胞扩散、迁移、分化等^[13]。呼吸系统疾病中，EMT作为气道重塑的重要特征，与支气管细胞功能及结构损伤密切相关，是肺功能障碍的重要预测因素^[14]。哮喘患者肺组织中，往往出现活化的成纤维/肌成纤维细胞，ECM（如胶原蛋白、纤连蛋白、基质金属蛋白酶⁃9）堆积、气道重塑^[15]。EMT作为肌成纤维细胞的重要来源途径，其事件特征为上皮细胞逐步转化为α⁃SMA阳性的肌成纤维细胞，失去E⁃cadherin等上皮标记物^[16]。本研究通过体外培养16HBE、建立支气管上皮细胞模型，首次证实选择性激活PAR2可通过氧化还原机制、诱导气道上皮发生EMT，细胞表型向间充质转化。PAR2的天然激动剂——类胰蛋白酶，通过上调细胞ROS信号、实现促EMT效应，可能是哮喘气道重塑、尤其是上皮重塑的重要机制之一。

肺和气道（包括支气管上皮细胞）存在大量PAR2表达，但其病理生理功能研究甚少。近期研究发现，肺纤维化患者肺组织PAR2表达上调^[17]；激活PAR2可诱导肺部炎症，引发成纤维细胞活化如增殖、迁移、分化为肌成纤维细胞等^[18]；同时，多项证据显示PAR2可通过介导气道上皮活化，促进基质金属蛋白酶⁃9的合成与分泌^[19]。上述系列研究结果均提示，PAR2的状态与气道结构及功能存在紧密联系。

类胰蛋白酶，作为机体内PAR2的天然激动剂，主要来源于肥大细胞，在炎症及过敏反应中发挥了重要作用^[20]。多项研究证实，其可促进成纤维细胞分化^[21]、诱导气道平滑肌细胞增殖^[22]，在肺纤维化的发生发展中十分关键。然而，类胰蛋白酶对气道上皮是否存在效应、与气道上皮发生EMT是否相关，目前所知甚少。本研究首次观测了PAR2活化对气道上皮表型及功能的影响，探究了16HBE细胞PAR2激活能否诱发EMT及其可能机制。结果显示予气道上皮细胞以类胰蛋白酶处理后，细胞逐步丧失上皮特征而向间充质表型转化，且呈浓度依赖性，提示类胰蛋白酶可诱导气道上皮EMT过程。

支气管上皮细胞EMT的潜在机制目前仍未完全阐明。研究表明，PAR2活化与线粒体ROS生成相关^[12]。事实上，细胞ROS水平是影响EMT过程的重要因素^[23]。而激活PAR2诱发气道上皮EMT是否经由氧化应激通路，至今仍未可知。本研究结果揭示，类胰蛋白酶通过激活气道上皮中的PAR2、促ROS生成，从而介导细胞EMT的发生。上皮细胞接受不同应激如理化因素、细胞因子等，可显著上调ROS水平、调控下游重要事件。上皮细胞ROS主要源自线粒体，是上皮实现诸多功能的公认信号分子，对细胞存活、细胞增殖分化、迁移、血管生成等至关重要^[11]。然而，过量产生的ROS可致上皮功能障碍、引起细胞氧化损伤，因此成为多种呼吸系统疾病如哮喘、肺纤维化、急性肺损伤的重要致病因子^[24-26]。

越来越多的证据显示，PAR2活化可促进不同类型细胞ROS产生。本研究围绕气道上皮表型与功能，发现PAR2经ROS信号、调控上皮EMT过程，可能为治疗多种慢性气道疾病如哮喘等提供新的治疗策略。本研究结果表明：①类胰蛋白酶促进16HBE细胞表型向间充质转化，即诱导气道上皮发生EMT；②气道上皮PAR2活化可引起细胞ROS大量产生；③ROS信号参与PAR2介导的EMT过程。研究首次证实激活PAR2可诱发和加重上皮细胞EMT，揭示ROS在PAR2介导EMT中的重要作用，为临床多种慢性气道疾病的防治提供了潜在靶点。然而作为胞内重要的信号分子，ROS来源较广。本研究揭示了ROS在类胰蛋白酶调控EMT过程中的重要作用，但未进一步探讨类胰蛋白酶上调ROS的具体分子机制；同时16HBE作为转化的永生系气道上皮细胞，与气液交界培养的原代气道上皮细胞有所差异，因此有待进一步深入探索。

参考文献