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第43卷第12期 余 清,徐 敏,史桂兰,等. 基于全基因组测序的院内耐碳青霉烯肺炎克雷伯菌耐药性及
2023年12月 同源性分析[J]. 南京医科大学学报(自然科学版),2023,43(12):1729-1736,1763 ·1731 ·
Illumina 数据再次用于验证,最后使用 GapCloser 使用试剂盒提取细菌DNA和质粒DNA,根据全
v1.12 软件用于 gap closing 的工作。全基因组测序 基因组测序结果选择相关的耐药基因和毒力基因,
委托上海美吉生物医药科技有限公司进行。 在临床泛耐药菌株中进行 PCR 扩增,扩增产物行
1.2.2 多位点序列分型(multilocus sequence typing, 1.2%琼脂糖凝胶电泳,验证携带情况。选择的基因
MLST)和脉冲凝胶电泳(pulse⁃field gel electrophore⁃ 如表1所示。
sis,PFGE)分型
2 结 果
采用7对管家基因对细菌DNA进行PCR扩增,
然后对扩增产物进行序列测定,将测许结果上传至 2.1 全基因组测序结果
数据库,与数据库比对后获取序列分型(sequence KPX全基因组测序全长5 468 925 bp,环状DNA,
type,ST)。 含有 4 个质粒(179 972 bp、141 377 bp、85 181 bp 和
PFGE分型操作为先提取细菌基因组DNA后再 20 247 bp),其中编码蛋白质的基因 5 984 个,tRNA
用限制性内切酶 XbaⅠ(日本 TaKaRa 公司)对菌株 基因 85 个,rRNA 操纵子 25 个。测序结果显示 KPX
基因组进行酶切,酶切片断在特定的电泳系统中通 携带多种抗生素耐药基因,包括 aadA2、rmtB、blaC⁃
过电场方向不断交替变换,电泳 15 h 后充分分离, TX⁃M⁃65、blaKPC⁃2、blaTEM⁃1、blaSHV⁃64、blaSHV⁃
根据电泳条带的位置和大小对细菌进行分型。 11、qnrS1、carA、sul1、sul2 和 catⅡ等。这些基因分
[5]
PFGE分型的判断参照Tenover等 提出的标准。 别能够介导细菌对氨基糖苷类、β内酰胺类、氟喹诺
1.2.3 耐药基因及毒力相关基因的PCR扩增 酮类、大环内酯类、磺胺类和氯霉素的耐药。此外,
表1 本实验中所用引物
Table 1 Primers used in this study
基因名称 序列(5′-3′) 片断长度(bp)
rmpA2_F AGAGTATTGGTTGATAGCCGGA 159
rmpA2_R GAAATGTCAAGCCACATCCATTG
iucABCD_F CCAACTCCGTCCGTACCCTGTCA 838
iucABCD_R CGAGGGATCGACGATGGTGTTCT
iutA_F AATCACCTGGGGGCTGGATGCT 683
iutA_R CCGCACCTTCCACGCCGTAAAT
KPC-2_F GCTACACCTAGCTCCACCTTC 990
KPC-2_R ACAGTGGTTGGTAATCCATGC
NDM-1_F GAAGCTGAGCACCGCATTAG 769
NDM-1_R GGGCCGTATGAGTGATTGC
TEM-1_F ACAGCGGTAAGATCCTTGAGAG 461
TEM-1_R GAAGCTAGAGTAAGTAGTTCG
SHV-11_F ACCTTTAAAGTAGTGCTCTGC 432
SHV-11_R CACCATCCACTGCAGCAGCTG
CTX-M_F ATGGTTAAAAAATCACTGCGTCACTGCGYCAGTTC 876
CTX-M_R TCACAAACCGTYGGTGACGATTTTAGCCGC
qnrS_F ACGACATTCGTCAACTGCAA 417
qnrS_R TAAATTGGCACCCTGTAGGC
int1_F CAGTGGACATAAGCCTGTTC 161
int1_R CCCGAGGCATAGACTGTA
sul1_F CGGCGTGGGCTACCTGAACG 433
sul1_D GCCGATCGCGTGAAGTTCCG
sul2_F GCGCTCAAGGCAGATGGCATT 289
sul2_D GCGTTTGATACCGGCACCCGT
oqxB_F CTGGATTTTCCGTCCGTTTAAC 068
oqxB_R TTGCCTACCAGTCCCTGATAGC