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第41卷第6期         朱晓东，许 是，蒋 玫，等. α7烟碱型乙酰胆碱受体基因敲除小鼠牙髓炎模型的构建［J］.
                  2021年6月                     南京医科大学学报（自然科学版），2021，41（06）：832-837                       ·833 ·


                    α7 烟碱型乙酰胆碱受体（α7 nicotine acetylcho⁃           尾尖，在小鼠无明显运动状况下，将小鼠四肢固定
                line receptor，α7 nAChR）作为一种常见的神经递质，               至手术台，用橡皮筋将小鼠的上颌切牙固定，放置
                大量存在于神经细胞中，同时α7 nAChR 参与的“胆                       到显微镜下，使用金属镊子在下颌切牙处，适当拉
                碱能抗炎途径”能够在类风湿关节炎、肺炎、毒血症                           开下颌和小鼠舌尖，镜下可清晰观察到上颌第一磨牙
                等炎症性疾病中发挥重要抗炎作用                ［1-4］ 。α7 nAChR    后，用75%的酒精将上颌第一磨牙进行消毒，1/4球钻
                受体是乙酰胆碱受体的一个亚型，它是由 5 个相同                          在涡轮机低速下磨除牙釉质和部分牙本质，清洗碎
                的α亚基组成并具有独特的活化特性和高钙渗透                             屑后吹干，使用#20 牙科扩大针进行加压穿刺，形
                性，参与了一系列神经、精神和炎症性疾病发生发                            成洞孔后，停止操作，开放牙髓腔；对照组 4 只小鼠
                展过程   ［5-6］ 。研究证实，其抗炎作用的关键靶标是炎                    仅麻醉，不进行牙髓开放。术后将小鼠置于37 ℃恒
                症部位免疫细胞上的α7 nAChR 受体 。研究发现                        温板上复苏，待小鼠苏醒后放回原饲养笼。分别在
                                                 ［7］
                大鼠的α7 nAChR基因敲除后，上颌骨软骨及骨髓成                        牙髓暴露 1 d、3 d、7 d 麻醉小鼠、心脏灌注后，取上
                        ［8］
                骨被抑制 。在人类牙周炎与α7 nAChR 的研究中                        颌骨，放入含有多聚甲醛的EP管中进行固定。
                发现α7 nAChR 可以降低牙周炎症及减少牙槽骨吸                        1.2.3 牙髓组织切片及HE染色
                收 。研究发现在小鼠胚胎期的外胚层和成年期牙                                上颌骨固定 24~48 h，PBS 冲洗，置于 4%EDTA
                 ［9］
                髓中均有α7 nAChR 的表达        ［10］ 。此外，α7 nAChR 基       中室温下脱钙 3~4 周。将标本脱水，石蜡包埋制备
                因敲除鼠在高浓度尼古丁的刺激下，牙槽骨吸收加                            5 μm 厚的石蜡切片后，进行脱蜡、水化、苏木素⁃伊
                重，细菌含量增加       ［11］ 。牙髓炎是一种炎症性疾病，α                红染色，脱水、透明、封片后镜下观察，采集图像。
                7 nAChR是否也在牙髓炎发生发展的过程中起到抗                         1.2.4 免疫组化染色
                炎作用，目前尚未见文献报道。因此，本研究拟构建                               5 μm石蜡切片，脱蜡、脱水，PBS冲洗；室温下，
                α7 nAChR KO小鼠上颌第一磨牙牙髓炎模型，为研究                      3% H2O2孵育30 min封闭内源性过氧化物酶，PBS冲
                α7 nAChR在牙髓炎发生发展过程中发挥的作用机制                        洗；37 ℃孵箱中1 g/L胰蛋白酶消化30 min暴露细胞
                提供实验模型。                                           内抗原，PBS冲洗；10%胎牛血清封闭30 min后滴加
                                                                  NLRP3（1∶500）一抗，4 ℃过夜，PBS冲洗5 min×3次；
                1  材料和方法
                                                                  滴加山羊抗兔二抗（1∶500），37 ℃避光孵育1 h，PBS
                1.1  材料                                           冲洗；DAB 显色，苏木素复染，梯度乙醇脱水，二甲
                    40 g/L 水合氯醛（分析纯 AR，国药集团有限公                    苯透明后中性树胶封片，显微镜下观察NLRP3阳性
                司）；牙科高速涡轮机（上海通达医疗器械）；牙科手                          细胞。观察正常和炎症牙髓组织中NLRP3的表达。
                机（上海通达医疗器械）；#20 牙科扩孔钻（登士柏，                        1.3  统计学方法
                瑞士）；苏木素染色液（北京索莱宝科技有限公司）；                              本研究测量的指标数据都是以均数±标准差
                伊红染色液（北京索莱宝科技有限公司）；正置显微                          （x ± s）表示。免疫组化的数据统计采用 Image J 统
                镜成像系统（DM4000，徕卡公司，德国）；NLRP3 一                     计，GraphPad Prism7.0软件进行Two⁃Way ANOVA检
                抗（Adipogen 公司，美国）；鼠二抗（Thermo Fisher 公             验进行分析。P＜0.05为差异有统计学意义。
                司，美国）。
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                1.2  方法
                1.2.1 实验动物                                        2.1  对照组牙髓组织学表现

                    选取 8~10 周的α7 nAChR KO 雄性小鼠及 WT                    α7 nAChR KO 鼠与 WT 鼠对照组牙髓组织中
                雄性小鼠各16只（来自于南京医科大学动物实验中                          （图1），釉质及牙本质完整，高柱状的成牙本质细胞
                心范益课题组），12只分为1 d组、3 d组、7 d组进行牙                    沿着牙本质排列，梭形状的成纤维细胞在成牙本质
                髓炎模型构建实验，4只未处理组作为对照组。本研                           细胞层下方，细胞间质均匀染色，无圆形炎症细胞
                究经南京医科大学实验动物福利伦理委员会批准。                            形成。NLRP3免疫组化染色结果中提示：在牙髓未
                1.2.2 小鼠牙髓炎模型的构建与取材                               暴露的情况下，牙髓细胞的胞质中未见阳性结果。
                    对 12 只 8~10 周的α7 nAChR KO 小鼠及 WT 小            2.2 髓腔开放1 d后的组织学表现
                鼠腹腔注射40 g/L水合氯醛，进行术前麻醉，注射量                            髓腔开放 1 d，对比正常小鼠的牙髓组织（图
                为 10 mL/kg。小鼠深度麻醉后，手指适当按压小鼠                       2），α7 nAChR KO 鼠及 WT 鼠第一磨牙的穿髓点处
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