Page 12 - 南京医科大学学报自然科学版

第42卷第1期
· 6 · 南 京 医 科 大 学 学 报 2022年1月

表2 F9敲除单细胞克隆基因型
Table 2 Genotypes of F9 knockout single cell clones

序号 目的片段 类型
WT …CAAAGAGGTATAATTCAGGCAAACTGGA//ACCTAACATCCTTCACATGCGGAGCAAA… WT
1 …CAATCAGGCATAATTCAAGCA-----------//ACCTAACATCCTTCACATGCGGAGCAAA… -11 bp
2 …CAAAGAGGTATAATTCAGGCAAAACTGTGGA//ACCTAACATCCTTCACATGCGGAGCAAA… +2 bp
3 …CAAAGAGGTATAATTCAGGCA------…//…------TCCTTCACATGCGGAGCAAA… -121 bp
4 …CAAAGAGGTATAATTCAGGCA------…//…------TCCTTCACATGCGGAGCAAA… -121 bp
5 …CAAAGAGGTATAATTCAGGCA------…//…------TCCTTCACATGCGGAGCAAA… -121 bp
6 …CAAAGAGGTATAATTCAGGCA//…------AAGAA… -117 bp
7 …CAAAGAGGTATAATTCAGGCAA------…//…------TCCTTCACATGCGGAGCAAA… -120 bp
8 …CAAAGAGGTATAATTCAGGCAA------…//…------TCCTTCACATGCGGAGCAAA… -120 bp
9 …CAAAGAGGTATAATTCAGGCAAACTGGA//-----------TTCACATGCGGAGCAAA… -11 bp
10 …CAAAGAGGTATAATTCAGGCAA------…//…------TCCTTCACATGCGGAGCAAA… -120 bp
11 …CAAAGAGGTATAATTCAGGCAA------…//…------TCCTTCACATGCGGAGCAAA… -120 bp
12 …CAAAGAGGTATAATTCAGGCA------…//…------TCCTTCACATGCGGAGCAAA… -121 bp
13 …CAAAGAGGTATAATTCAGGCAA-CTGGA// ACCTAACATCCTTCACATGCGGAGCAAA… -1 bp
14 …CAAAGAGGTAACGCCGGAT------…// …------ATGCGGAGCAAA… +9 bp，-140 bp
15 …CAAAGAGGTATAATTCAGGCAAAACTGGA// ACCTAACATC-TTCACATGCGGAGCAAA… +1 bp，-1 bp
16 …CAAAGAGGTATAATTCAGGCA------…//…------TCCTTCACATGCGGAGCAAA… -121 bp
17 …CAAAGAGGTATAATTCAGGCAA------…//…------TCCTTCACATGCGGAGCAAA… -120 bp
18 …CAAAGAGGTAT------…//…------TCCTTCACGTGCGCTGCAAA… -132 bp
19 …CAAAGAGGTATAATTCA----AACTGGA// ACCTAAC---CTTCACATGCGGAGCAAA… -7 bp
20 …CAAAGAGGTATAAT------…//…------ ATCCTTCACATGCGGAGCAAA… -127 bp
21 …CAAAGAGGTATAATTCAGGCAA------…//…------TCCTTCACATGCGGAGCAAA… -120 bp
22 …CAAAGAGGTATAATTCAGGC---CTGGA// ACCTAACATCCTTCACATGCGGAGCAAA… -3 bp
23 …CAAAGAGGTATAATTC--------TGGA// ACCTAACATCCTTCACATGCGGAGCAAA… -8 bp
24 …CAAAGAGGTATAATTCAGGCAAAACTGGA// ACCTAACAATCCTTCACATGCGGAGCAAA… +2 bp
25 …CAAAGAGGTATAATTCAGGCAA-CTGGA// ACCTAACAACCTTCACATGCGGAGCAAA… -1 bp，+1 bp
首行加黑加粗处为靶序列；WT为野生型；+为增加；-为删除；红色字母为突变的碱基；蓝色字母为增加的碱基。

序列相关核酸酶（CRISPR/Cas9）技术在鼠和人类细 技术成功构建了多个猪模型。2015年Chen 等 ［19］ 构
胞中实现了基因编辑，开启了基因编辑技术新篇 建的 3 只 B 细胞缺陷仔猪；2018 年 Zhang 等 ［12］ 构建
章。此后，利用 CRISPR/Cas9 技术构建的血友病动 的 GGTA1、CMAH 和β4GalNT2 三基因敲除猪；2019
物模型，尤其是多种小鼠血友病模型得到了极大的 年 Yao 等 ［20］ 构建的听力缺陷猪。以上成果表明了
发展，为研究血友病提供了便利。 CRISPR/Cas9 技术在构建基因修饰猪方面的可行
然而，小鼠与人类之间存在明显的物种差异， 性和便捷性。本研究利用 2 个 sgRNA 对巴马小型
并非构建血友病动物模型的最佳选择，深入研究血 猪的胎儿成纤维细胞的 F9 基因进行打靶。CRIS⁃
友病亟需一个与人类生理、病理情况更为相似的动 PR/Cas9 表达质粒转染细胞后经过药物筛选，获得
物模型。猪在遗传背景、生理特点及疾病发生发展 55 个单细胞克隆。基因型分析显示其中有 25 个单
等方面具有小鼠无法比拟的优势，且猪的凝血系统 细胞克隆在靶点处发生了基因突变［（包含15个大
与人类极为相似，更符合血液病动物模型的需求。 片段缺失（> 100 bp），8个小片段缺失（< 100 bp），5
本研究通过分析人和猪F9的遗传距离，以及对人和 个碱基的插入，4 个碱基的突变］，敲除效率高达
猪 FⅨ氨基酸序列、蛋白质二级结构及三级结构的 45.5%。本研究结果显示在进行基因敲除时，在靶
模拟与分析，揭示了人与猪 FⅨ的高度同源性。因 点处使用2个sgRNA是较为理想的选择。
此，猪是构建血友病乙动物模型的良好选择。此外， 综上，本研究通过高效的 CRISPR/Cas9 打靶载
本课题组利用CRISPR/Cas9技术结合体细胞核移植 体成功获得了巴马小型猪F9基因敲除细胞系，为接