Page 22 - 南京医科大学学报自然科学版

第42卷第2期
·168 · 南 京 医 科 大 学 学 报 2022年2月

ROS的影响。HCASMC 在5 mmon/L糖浓度（NG组， （S473）蛋白表达进行比较，P < 0.05 为差异有统计
n=3）、15 mmon/L糖浓度（HG组，n=3）、15 mmon/L糖 学意义。
浓度+GKT137831（HG+GKT组，n=3）孵育48 h后，用
2 结 果
PBS洗涤2次，然后加入DCFHDA 10 μL和90 μL无
血清 SMBM 培养基 37 ℃培养 30 min，孵育后用 PBS 2.1 不同糖浓度下HCASMC中BK⁃α、BK⁃β1、DNA⁃
洗涤 2 次，荧光显微镜 480~525 nm检测DCF荧光强 Pkcs、Akt、p⁃Akt的表达
度。快速冰冻的大鼠冠状动脉血管环被切割成30 μm 与 5 mmol/L 葡萄糖浓度下的 HCASMC 比较，
厚的切片，并放置在玻璃玻片上（DM，n=3；DM+GKT， 15 mmol/L葡萄糖浓度下HCASMC中BK⁃α表达无明

n=3）。DCFH⁃DA（25 μmon/L）应用于组织切片，37 ℃ 显变化，BK⁃β1 蛋白表达降低（P < 0.05），DNA⁃
避光孵育30 min，荧光显微镜480~525 nm 检测DCF Pkcs、Akt、p⁃Akt的表达增高（P < 0.05，图1）。
荧光强度，将使用Scion Image软件对DCF信号进行 2.2 Wortmannin 处 理 HCASMC 后 BK ⁃ β1、DNA ⁃
进一步的密度分析。 Pkcs、Akt、p⁃Akt的表达

1.2.4 采用蛋白免疫印迹（Western blot）检测HCASMC HCASMC 以 Wortmannin（100 nmol/L）预 处 理
及大鼠冠状动脉BK⁃a亚基、BK⁃β1亚基、DNA⁃Pkcs、 30 min后，在15 mmol/L葡萄糖浓度的SMBM中培养
Akt、p⁃Akt（S473）表达 48 h 并和对照组相比较，Wortmannin 处理组，DNA⁃
等量蛋白分别行8％~12％丙烯酰胺凝胶电泳， Pkcs、Akt 的表达无明显变化（P > 0.05），p⁃Akt 蛋白
5％脱脂牛奶室温封闭1 h，一抗4 ℃封闭过夜，洗膜， 表达量明显降低，BK⁃β1 的表达量明显增高（P <
HRP标记二抗室温封闭2 h。洗膜后再用GAPDH抗 0.05，图2）。
血清封闭，ECL试剂盒发光，吸光度分析法定量。 2.3 GKT137831 作 用 于 15 mmol/L 糖 浓 度 下 的
1.3 统计学方法 HCASMC 48 h后BK⁃β1、DNA⁃Pkcs、Akt、p⁃Akt的表达
以SPSS 11.5统计分析软件进行分析，计量资料 与15mmol/L糖浓度下的HCASMC比较，15mmol/L
以均数士标准差（x ± s）表示。采用 t 检验对正常组 糖浓度下HCASMC经GKT137831处理48 h后，DNA
和糖尿病组 BK⁃a、BK⁃β1、DNA⁃Pkcs、Akt、p⁃Akt ⁃Pkcs、Akt、p⁃Akt蛋白表达降低（P < 0.05），BK⁃β1表

NG HG NG HG NG
DNA⁃Pkcs 460 kDa Akt 56 kDa 1.0 HG
BK⁃α 125 kDa p⁃Akt 56 kDa 蛋白相对表达量 1.2
0.8
28 kDa GAPDH 36 kDa 0.6 * * *
BK⁃β1 0.4 *
GAPDH 36 kDa 0.2
0.0
BK⁃α BK⁃β1 DNA⁃Pkcs Akt p⁃Akt

NG：5 mmol/L葡萄糖浓度；HG：15 mmol/L糖浓度，与NG组比较，P < 0.05（n=3）。
*
图1 Western blot检测不同葡萄糖浓度下HCASMC中BK⁃α、BK⁃β1、DNA⁃PKcs、Akt、p⁃Akt（S473）的表达
Figure 1 Expression of BK⁃α，BK⁃β1，DNA⁃PKcs，Akt and p⁃Akt（S473）of human coronary artery smooth muscle cells in
different glucose concentrations by Western blot

Wort（-） Wort（+） Wort（-） Wort（+） 2.0 Wort（-）
蛋白相对表达量 1.0
DNA⁃Pkcs 460 kDa Akt 56 kDa 1.5 Wort（+）
28 kDa *
BK⁃β1 p⁃Akt 56 kDa
GAPDH 36 kDa GAPDH 36 kDa 0.5 *

0.0
BK⁃β1 DNA⁃Pkcs Akt p⁃Akt
Wortmanin预处理HCASMC 30 min后在15 mmol/L糖浓度下培养48 h，与正常对照组比较，P < 0.05（n=3）。
*
图2 Western blot检测Wortmannin作用于HCASMC后BK⁃β1、DNA⁃Pkcs、Akt、p⁃Akt（S473）的表达
Figure 2 Expression of BK⁃β1，DNA⁃Pkcs，Akt and p⁃Akt（S473）of human coronary artery smooth muscle cells treated
with Wortmannin by Western blot