Page 23 - 南京医科大学学报自然科学版

第43卷第4期 蒋 宇，汤 郁，陈 頔，等. 类风湿关节炎患者CD4 CD25 CD127 调节性T细胞CXCR4的
-
+
+
2023年4月 研究［J］. 南京医科大学学报（自然科学版），2023，43（04）：459⁃467 ·461 ·
体 < 5 U/mL）、5 U/mL≤抗 CCP 抗体 < 200 U/mL 组 CD4 T 细胞中 CD4 CD25 CD127 Treg 的比例，计算
+
+
-
+
和抗CCP抗体≥200 U/mL组。 Treg细胞迁移率：迁移率（%）=迁移到下室的Treg的
1.2.2 外周血CXCR4 Treg的检测 细胞数/（加入上室的 CD4 T 细胞中 CD4 CD25 +
+
+
+
5
-
用肝素抗凝负压采血管分别抽取 RA 组及 HC CD127 Treg的比例×2×10）。
组静脉外周血，取80 μL全血加入流式上样管，分别 1.3 统计学方法
加入 5 μL CD4 抗体、20 μL CD25 抗体、5 μL CD127 采用 SPSS 25.0 统计学软件分析数据，计量资
抗体及 2 μL CXCR4 一抗混匀，并于 4 ℃、避光条件 料满足正态分布时以均数±标准差（x ± s）表示，两
下孵育 30 min；加入 1 mL 红细胞裂解液混合均匀， 组间比较采用独立样本 t 检验或配对 t 检验；不符
常温避光放置 10 min，1 500 r/min 离心 5 min，弃上 合正态分布时以中位数（四分位数）［M（P25，P75 ）］
清，随后PBS缓冲液洗涤1次，加入100 μL Buffer 缓 表示，两组间比较采用非参数秩和检验。多组间
冲液重悬细胞；加入 0.5 μL CXCR4 二抗混匀，4 ℃ 比较，符合正态分布时采用 F 检验、组间两两比
避 光 孵 育 20 min；PBS 缓 冲 液 洗 涤 2 次 ，200 μL 较采用 SNK⁃q 检验，不符合正态分布或方差不齐
Buffer 缓 冲 液 重 悬 并 上 机 检 测 ，每 个 样 本 收 集 时采用 Kruskal⁃Walls H 检验、组间两两比较采用
5 000~10 000 个细胞，采用 FlowJo10.0 分析检测数 Mann⁃Whitney U 检验；相关性分析正态分布资料采
据，记录 CD4 CD25 CD127 Treg 及 CXCR4 Treg 的 用Pearson相关，不符合正态分布的资料用Spearman
-
+
+
+
百分比。 等级相关，P < 0.05为差异有统计学意义。
+
1.2.3 关节滑液CXCR4 Treg的检测
2 结 果
采用Ficoll 密度梯度离心法分离关节液单个核
细胞（synovial fluid mononuclear cell，SFMC）。具体 2.1 一般临床资料
方法如下：关节穿刺术抽取 RA 和 OA 组膝关节腔 共纳入 RA 患者 51 例，其中，女 38 例，男 13 例，
积液 5~10 mL，1 500 r/min 离心 5 min，弃上清，加入 年 龄（60.78 ± 10.29）岁 ，病 程 0.5~46 年 ，中 位 病
1~2 mL PBS重悬，缓慢加至4 mL淋巴细胞分离液上 程 10（2，17）年。OA患者8例，其中，男3例，女5例，
层，2 500 r/min离心20 min，吸取中间白膜层单个核 平均年龄（57.89 ± 11.41）岁。HC 组 40 例，其中，男
细胞，PBS 洗涤 2 次（1 500 r/min 离心 5 min），Buffer 11 例，女 29 例，平均年龄（56.53±10.86）岁，RA 组
缓冲液重悬细胞，调节SFMC浓度为1×10 个/mL，随 与 HC 组年龄及性别分布无统计学差异（P > 0.05，
7
后按上述步骤标记细胞表面 CD4、CD25、CD127 及 表1）。
CXCR4分子，并上机检测CD4 CD25 CD127 Treg 及
+
-
+
表1 RA患者临床资料
CXCR4 Treg的比例。
+
Table 1 Clinical characteristic of RA patients
1.2.4 磁珠分选
临床资料 数值
采用Ficoll密度梯度离心法分离RA患者和健康 年龄（岁，x ± s） 60.78 ± 10.29
人外周血单个核细胞（peripheral blood mononuclear 性别（女/男，n） 38/13
cell，PBMC），按EasySep 说明书使用CD4免疫磁珠 病程［年，M（P25，P75 ）］ 10（2，17）
TM
正选试剂盒分选CD4 T细胞，流式检测CD4 T细胞 DAS28评分（分，x ± s） 4.37 ± 1.53
+
+
纯度大于95%，用于后续实验。 RF阳性率［n（%）］ 33（64.71）
1.2.5 Treg迁移测定 抗CCP抗体阳性率［n（%）］ 38（74.51）
使用 CXCL12 作为趋化介质，对纯化的外周血 5~ < 200 U/mL 15（29.41）
≥ 200 U/mL 23（45.10）
CD4 T 细胞进行迁移测定。用含有 10%胎牛血清
+
ESR［mm/h，M（P25，P75 ）］ 28（14，57）
（FBS）的RPMI 1640重悬CD4 T细胞，将含2×10 个
5
+
CRP［mg/L，M（P25，P75 ）］ 9.2（3.2，22.7）
CD4 T细胞的100 μL细胞悬液置于Transwell上室， IL⁃6［pg/mL，M（P25，P75 ）］ 20.62（5.92，44.49）
+
下 室 加 入 600 μL 含 0.1 μg/mL CXCL12 的 RPMI
+
-
+
1640+10% FBS培养液，在37 ℃、5% CO2细胞培养箱 2.2 RA患者外周血CD4 CD25 CD127 Treg及CXCR4 +
中 孵 育 24 h 后 收 集 下 室 细 胞 ，用 CD4、CD25 和 Treg比例
CD127 抗体染色，并通过流式细胞术检测迁移到下 RA 患者外周血中 CD4 CD25 CD127 Treg 占
-
+
+
室的 Treg 细胞数。流式细胞术检测纯化的外周血 CD4 T 细 胞 比 例 为（3.79 ± 1.72）% ，低 于 HC 组
+