Page 36 - 南京医科大学学报自然科学版
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第43卷第5期
               ·618 ·                            南 京    医 科 大 学 学         报                        2023年5月


                  胃癌是一种常见的消化道恶性肿瘤，是全球                           吉玛制药技术有限公司）；空载体、hsa_circ_0001479
              第四大癌症死亡原因，仅次于肺癌、结直肠癌和肝                            pcDNA（广州吉赛生物科技有限公司）；CCK⁃8 试剂
              癌 。尽管近年来胃癌发病率有所下降，但由于缺                            盒（Dojindo 公司，日本）；Transwell 小室（BD 公司，
                ［1］
              乏有效的早期诊断指标，胃癌患者的治疗效果不                             美国）；细胞周期检测试剂盒（北京索莱宝科技有
              佳，预后差，死亡率较高          ［2-3］ 。目前，手术治疗是胃癌            限公司）。
              唯一的根治性治疗方法，放化疗或其他治疗方法常                            1.2  方法
              作为辅助治疗手段与手术结合使用                 ［4-5］ 。因此，对胃      1.2.1 RT⁃qPCR
              癌发生发展的分子机制进行更广泛和深入的研究对                                 根据说明书使用TRIzol试剂从胃癌及癌旁组织
              寻找新的诊断指标和治疗靶点，改善胃癌患者预后，                           或细胞中提取总 RNA。用分光光度计测定每个
              提高存活率有重要意义。环状 RNA（circular RNA，                   RNA 样本的浓度。参照说明书用逆转录试剂盒将
              circRNA）是一类具有闭合环状结构且多不具有蛋                         总 RNA 反转录成互补 DNA（cDNA），反应条件为
              白编码能力的 RNA 。由于具有稳定的环状结构，                          25 ℃ 5 min，42 ℃ 1 h，70 ℃ 5 min，4 ℃保存。在
                               ［6］
              不易降解，且表达具有组织和疾病特异性，CircRNA                        Light Cycler 480 PCR 仪（Roche 公司，美国）上使用
                                                      ［7］
              有望成为新型肿瘤标志物和治疗靶点的潜力 。为                            SYBR Green Ⅰ mix 通过 RT⁃qPCR 检测 circRNA 的
              探寻新的胃癌差异circRNA，本文结合文献circRNA                     表达量，反应条件为 95 ℃ 10 min，95 ℃ 15 s，60 ℃
                      ［8］
              芯片结果 并经实时荧光定量PCR（RT⁃qPCR）初步                       30 s，72 ℃ 30 s，共 45 个循环。以 18s rRNA 作为内
              验证发现 hsa_circ_0001479 可能在胃癌组织中高表                  参，hsa_circ_0001479 的引物序列为 F：5′⁃ATCTTC⁃
              达，因此选择该分子进行更深入的研究。本研究                             GAAAACATACAGAGCAGC⁃ 3′和 R：5′⁃AACTCCT⁃
              首次验证了 hsa_circ_0001479 在胃癌组织中表达                   GAAGGCATTCCATC⁃3′；18s rRNA的引物序列为F：
              增高并探究了其对胃癌细胞增殖、侵袭和迁移能                             5′⁃GTAACCCGTTGAACCCCATT⁃3′和 R：5′⁃CCATC⁃
              力的影响，从而初步阐明其在胃癌发生发展中的                             CAATCGGTAGTAGCG⁃3′；ZNF131 的引物为 F：5′⁃
              作用。                                               ACACGTGTGCAAACTGAACC ⁃ 3′ 和 R：5′ ⁃ CCTG⁃
                                                                GAGCAGATCTGGATGG⁃3′。用 2       -ΔΔCt 法对目的分子
              1  材料和方法
                                                                和内参分子进行相对定量分析。
              1.1  材料                                           1.2.2 RT⁃qPCR方法学性能评价实验
                  收集2017年6月—2020年7月在南通大学附属                           精密度评价：依据 EP15⁃A2 文件制定的定量检
              医院手术的胃癌及配对远端癌旁组织76例（男57例，                         测方法精密度性能评价标准，选用6 μg组织RNA和
              女 19 例），年龄 37~82 岁。组织标本一经取出立即                     3 μg细胞RNA逆转录得到的高低2个浓度的cDNA
              置于-80 ℃冰箱保存。所有标本均在放化疗前采                           作为实验样本，每天检测1个批次，2份样本，每份样
              集，并经病理确诊。本研究经南通大学附属医院伦                            本重复测定4次，连续检测5 d。
              理委员会批准。4 株胃癌细胞株（MGC⁃803、SGC⁃                           正确度评价：收集目的分子的 RT⁃qPCR 产物
              7901、MKN⁃45 和 BGC⁃823）及 1 株正常胃黏膜上皮                50 μL 并送测序公司进行测序，得到的测序结果与
              细胞株（GES⁃1）均购自中国科学院上海生命科学研                         Circbase 数据库提供的分子序列进行比对，观察碱
              究细胞资源库。                                           基顺序是否一致，扩增片段中是否包含环化位点；将
                  本研究使用的试剂为TRIzol（Invitrogen公司，美                目的分子与内参分子的RT⁃qPCR产物进行琼脂糖凝
              国）；逆转录试剂盒（Thermo 公司，美国）；DEPC 水、                   胶电泳，观察产物片段大小与预期是否一致。
              18s rRNA 引物和 ZNF131 引物（上海生工生物工程                        线性范围评价：将细胞RNA逆转录得到的cDNA
              股份有限公司）；hsa_circ_0001479 引物（广州锐博                  以 10 倍倍比稀释，设立 5~7 个浓度梯度，通过 RT⁃
              生物科技有限公司）；SYBR GreenⅠmix（北京百泰                     qPCR 检测线性范围，用 GraphPad Prism 7 软件进行
              克生物技术有限公司）；核糖核酸酶 R（Rnase R）                       线性回归分析并作图。

             （Epicentre 公司，美国）；RPMI 1640 培养基和 Matri⁃            1.2.3 转染与细胞增殖、迁移和侵袭能力检测
              gel 胶（Corning 公司，美国）；Lonsera 特级胎牛血清                    转染：将MKN⁃45、BGC⁃823和SGC⁃7901细胞株

             （上海双洳生物科技有限公司）；siNC、hsa_circ_                      分别培养于 6 孔板中，分为对照组和干扰或过表达
              0001479 siRNA 和 GP⁃transfect⁃Mate 转染试剂（上海         组 ，使 用 GP ⁃ transfect ⁃ Mate 转 染 试 剂 将 siNC 和
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