Page 88 - 南京医科大学学报自然科学版
P. 88

第43卷第5期
               ·670 ·                            南 京    医 科 大 学 学         报                        2023年5月


              enhance the antioxidant activity of MC3T3⁃E1 cells and promotes the osteogenic differentiation of cells in an oxidative environment.
             ［Key words］ Prussian blue nanozyme；reactive oxygen species；antioxidant；osteogenesis differentiation；bone tissue engineering
                                                                            ［J Nanjing Med Univ，2023，43（05）：669⁃677］





                  组织工程的引入使骨组织修复技术得到了发展，                         持在正常细胞水平，这一理论可以给PB在骨组织工
              其中关键要素包括支架、细胞和生物活性因子 ，以                           程领域中的应用提供支持。
                                                       ［1］
              细胞为基础的颌骨再生技术已经逐步走向了临
                                                                1  材料和方法
              床 ［2］ 。MC3T3⁃E1 是小鼠颅骨成骨细胞的前体细
              胞，主要功能是产生骨基质、分泌Ⅰ型胶原、调节骨                           1.1  材料
              基质的矿化和破骨细胞的骨吸收等，各种因素导致                                 PVP包裹的PB（南京东纳生物科技有限公司）；
              的成骨细胞活性下降均可引起骨质减少和骨质疏                             透射电子显微镜（transmission electron microscopy，
                        ［3］
              松症的发生 ，因此，增加成骨细胞活性是预防和治                           TEM，FEI Tecnai G2 F30，美国）；扫描电子显微镜
              疗骨缺损疾病的关键之一 。                                     （scanning electron microscope，SEM，TESCAN MAIA3
                                     ［4］
                  活性氧（reactive oxygen species，ROS）是正常氧          公司，捷克）；纳米粒度及Zeta电位分析仪（ZS90 NANO
              代谢中氧气反应生成水过程的中间产物，在生物体                            公 司 ，英 国）；傅 里 叶 红 外 光 谱 仪（Fourier trans⁃
              中起到细胞传导和保持机体氧化平衡的作用。但                             formed infrared，FTIR，Thermo Scientific 公司，美国）；
              高水平的 ROS 会诱导细胞中包括核酸和蛋白质在                          倒置荧光显微镜（Leica 公司，德国）；Spectra Max
              内的生物分子氧化，导致细胞功能障碍甚至细胞                             190 酶标仪（Molecular device 公司，美国）；小鼠颅骨
              死亡 。此外，过量产生的H2O2会加剧损伤部位的                          成骨细胞系 MC3T3⁃E1（上海中国科学院细胞库）；
                  ［5］
              炎症反应，减缓骨缺损的愈合。已有研究发现，ROS                          胎牛血清（上海 Cyagen 公司）；α⁃MEM 基础培养基
                                                   ［6］
              水平升高会抑制间充质干细胞的成骨分化 。因此，                           （Gibco 公司，美国）；MC3T3⁃E1 细胞成骨诱导分化
              需要激活抗氧化酶以防止ROS的过度积累。                              培养基（上海Cyagen公司）；0.25%胰酶（Gibco公司，
                  然而，天然的抗氧化酶具有制备和提纯工艺复                          美国）；磷酸盐缓冲液（phosphate buffered solution，
              杂、不稳定、易变性、对环境条件要求严苛等缺点，因                          PBS，武汉 Servicebio 公司）；CCK⁃8 试剂盒（合肥
              此人们提出了“人工酶”的概念。2007年，Gao等 发                       Biosharp 公司）；H2O2检测试剂盒（上海碧云天）；总
                                                        ［7］
              现四氧化三铁纳米颗粒内在的类过氧化物酶（per⁃                          SOD 活性检测试剂盒（WST⁃8 法，上海碧云天）；
              oxidase，POD）活性，首次提出了纳米粒子模拟酶的                      DCFH⁃DA探针（北京Solarbio公司）；ROS试剂盒（北
              概念。近几年，普鲁士蓝纳米酶（Prussian blue nano⁃                京Solarbio公司）；碱性磷酸酶（ALP）测试盒（上海碧
              zyme，PB）由于其出色的模拟酶活性和良好的生物                         云天）；BCA蛋白定量试剂盒（上海碧云天）；茜素红
              安全性，受到了广泛关注。研究发现，PB具有POD、                         染色液（上海 Cyagen 公司）；RNA 提取试剂盒（北京
              过氧化氢酶（catalase，CAT）、超氧化物歧化酶（su⁃                   天根生化科技有限公司）；RT⁃PCR 逆转录试剂盒、
              peroxide dismutase，SOD）、抗坏血酸氧化镁（ascorbic          SYBR Green Premix Ex TaqⅡ（TaKaRa 公司，日本）；
                                               ［8］
              acid oxidase，AAO）等多种模拟酶活性 。已经有研                   QuantStudio7 荧光定量 PCR 仪（ABI 公司，美国）；细
              究把 PB 作为天然辣根过氧化物酶（horseradish per⁃                胞培养箱（Heraeus公司，德国）。
              oxidase，HRP）的替代品，应用于纸基比色葡萄糖                       1.2  方法
              传感，有效节省了成本，展现出巨大的临床应用价                            1.2.1 PB的表征
              值 。还有研究者利用PB的多酶活性治疗小鼠结肠                                通过透射电子显微镜观察PB的形态和大小，并
                ［9］
              炎 和促进皮肤伤口愈合 ，均取得了不错的疗效。                           通过高分辨率透射电子显微镜观察PB表面晶格；通
                ［10］
                                    ［11］
                  本研究在细胞层面初步验证了氧化微环境下                           过扫描电子显微镜观察 PB 粒径和表面形貌。收集
              PB 的抗氧化促进成骨分化作用，即可以利用 PB 模                        和 PB 溶液一起培养 24 h 的 MC3T3⁃E1 细胞沉淀，
              拟CAT活性和模拟SOD活性，调节细胞培养微环境                          2.5%戊二醛固定制样后透射电镜下观察细胞内结
              中和细胞内的ROS浓度，进而调节细胞成骨分化能                           构和PB胞吞情况。
              力，使受到H2O2阳性刺激的细胞的成骨分化能力维                               测量 PB 的紫外⁃可见光吸收光谱（UV⁃VIS），确
   83   84   85   86   87   88   89   90   91   92   93