Page 10 - 南京医科大学自然版
P. 10

第44卷第4期
               ·448 ·                            南 京    医 科 大 学 学         报                        2024年4月


                                                                                             TM
              1.2.7  肝脏组织TC、TG检测                                     液氮研磨组织，加入 TRIzol 试剂后提取组织
                  肝脏组织 TC、TG 表达水平根据检测试剂盒说                       总 RNA，随后加入反转录试剂将 RNA 逆转录为
              明书进行操作。首先将组织加入无水乙醇匀浆后                             cDNA。各组肝脏组织Chop、Bip、Atf6、Atf4、Xbp⁃1s基
              离心制备上清待检；96孔板依次加入空白、标准品、                          因表达通过实时荧光定量PCR仪进行扩增检测，扩
              样本 2.5 μL、工作液 250 μL 后 37 ℃孵育 10 min；酶            增条件为95 ℃预变性5 min、95 ℃ 10 s、65 ℃ 1 min共
              标仪检测各孔510 nm吸光值后绘制标准曲线，结合                         39个循环；熔解曲线反应条件为65~95 ℃每隔0.5 ℃
              蛋白浓度计算出结果。                                        进行信号检测绘制；内参基因为β⁃actin，各组基因表
              1.2.8  实时荧光定量 PCR 法（quantitative real⁃time        达差异采用 2      -ΔΔCT 相对定量法进行分析。本实验引
              PCR，RT⁃qPCR）检测肝脏组织ERS相关基因表达                       物序列见表1。


                                                        表1   引物序列
                                                    Table 1  Primer sequences

                        Gene                  Forward（5′→3′）                      Reverse（5′→3′）
                       Chop            AAGCCTGGTATGAGGATCTGC               TTCCTGGGGATGAGATATAGGTG
                       Bip             GCATCACGCCGTCGTATGT                 ATTCCAAGTGCGTCCGATGAG
                       Atf6            TGCCTTGGGAGTCAGACCTATGG             CTGTGGACCGAGGAGAGGAGATG
                       Atf4            AGTTTAGAGCTAGGCAGTGAAG              CATACAGATGCCACTGTCATTG
                       Xbp⁃1s          AGCTTTTACGGGAGAAAACTCAC             CCTCTGGAACCTCGTCAGGA



              1.2.9  蛋白印迹（western blot，WB）法检测ERS相关              细胞接种于 96 孔板，经 PA 或 TM 处理及药物干预
              蛋白表达                                              后，向各组细胞培养基中加入1/10体积的CCK⁃8试
                  肝脏组织及细胞加入 RIPA 裂解液后匀浆提取                       剂，37 ℃孵育2~4 h后，采用酶标仪检测在450 nm波
              组织总蛋白，BCA 试剂盒测定蛋白浓度后经高温                           长下的吸光值，计算细胞相对活性。
              变性后保存于-80 ℃备用。蛋白经凝胶电泳后，                           1.3  统计学方法
              350 mA、40 min 快速转移至 PVDF 膜，5%脱脂牛奶                      通过SPSS 25.0软件进行数据分析，实验数据以
              室温封闭1 h后加入相应一抗：BiP（1∶1 000）、CHOP                  均数±标准差（x ± s）表示，对于符合正态分布的数
             （1∶1 000）、ATF4（1∶1 000）、ATF6（1∶1 000）、XBP⁃1s       据，采用t检验进行组间比较；对于多组数据先进行
             （1∶500）、XBP⁃1u（1∶500）和β⁃actin（1∶3 000），4 ℃孵        单因素方差分析，而后进行多组组间比较，P < 0.05
              育过夜；次日 PBST 清洗 3 次后加入二抗（1∶5 000）                  为差异有统计学意义。
              常温孵育 1 h；PBS 吐温缓冲液清洗 3 次后加入 ECL
                                                                2 结     果
              显影液进行曝光，各组蛋白灰度值通过Image J软件
              进行灰度计算，经内参蛋白灰度值进行校正（即对                            2.1  Que对NAFLD大鼠生理指标、血脂代谢的影响
              照组蛋白表达值为1），得出各组蛋白相对表达量。                                体重监测结果显示各组大鼠在饲养期间体重、
              1.2.10 细胞培养及分组                                    进食量差异无统计学意义（图1A、B）。与Control 组
                  人 HepG2 细胞系在 37 ℃、5% CO2条件下培养                 比较，HFD 组大鼠血清 TG、TC、LDL⁃C 浓度增加
              于 DMEM 高糖培养基中。通过加入 400 μmol/L PA                 （P < 0.05），HDL⁃C 浓度降低（P < 0.05）；与 HFD 组
              诱导24 h建立细胞脂毒性损伤模型（模型组），同时                         比较，HFD+Que（L）组大鼠血清TG、TC、LDL⁃C 浓度降
              根据经前期实验结果设立Que（100 μmol/L）干预组，                    低（P < 0.05），HDL⁃C浓度升高但差异无统计学意义
              Que 在模型组给药时随 PA 一起加入细胞培养基                        （P > 0.05）；与 HFD 组比较，HFD+Que（H）组大鼠血
              中 。 此 外 ，通 过 ERS 诱 导 剂 TM（1 μg/mL）诱 导             清 TG、TC 浓度降低（P < 0.05），LDL⁃C 浓度稍降，差

              HepG2 细胞 24 h 建立细胞 ERS 模型，同时设立 Que                异无统计学意义（P > 0.05），HDL⁃C 浓度升高，差异
             （100 μmol/L）干预组，干预方法为Que随TM一同加                     无统计学意义（P > 0.05，图1C~F）。
              入细胞培养基中。                                          2.2 Que对NAFLD大鼠肝脏形态和功能的影响
              1.2.11 CCK⁃8细胞活性检测                                     与Control组比较，HFD组大鼠血清肝脏功能指
                  通过 CCK⁃8 细胞活性试剂盒检测细胞活性。                       标 AST 和 ALT 浓度升高，与 HFD 组比较，HFD+Que
   5   6   7   8   9   10   11   12   13   14   15