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第44卷第4期 陈佳丽，夏 天，周其冈. 检测蛋白质相互作用方法的进展［J］.
2024年4月 南京医科大学学报（自然科学版），2024，44（04）：536-545 ·541 ·

表1 基于生物化学与分子生物学的研究方法的优缺点
Table 1 Advantages and disadvantages of research methods based on biochemistry and molecular biology

Method Advantage Disadvantage
Yeast two⁃hybrid（Y2H） Detecting physical interactions between The automatic activation of reporter genes leads to
any two proteins in different species high false positives in the results
Co⁃immunoprecipitation（Co⁃IP） The detected protein interactions are Unable to determine whether PPI has a direct effect；
formed in their natural state unable to detect PPI with instantaneous action and
low affinity
Pull⁃down Detecting direct interactions between two Inability to fully reflect the true interaction state of
purified proteins intracellular proteins
Tandem affinity purification（TAP） Increased specificity TAP labeling and eluents during purification pro⁃
cess may interfere with PPI
Phage display technology（PDT） Tightly linking genotype and phenotype Limited by the capacity and diversity of peptide
libraries
Protein chip Microization, high⁃through put Excessive cost
Bimolecular fluorescence comple⁃ Visualize PPI in living cells Temperature sensitive
mentation（BiFC）
Proximity ligation assay（PLA） Visualize PPI Cannot be used for living cells
PDB⁃MS（HRP） Identifying PPI on the surface of living cells Large marking radius leads to false positive results
PDB⁃MS（APEX） Strong labeling specificity for mitochondrial Large marking radius leads to false positive results
proteins
PDB⁃MS（BioID） Simple and non⁃toxic Large marking radius leads to false positive results

确地对分子间作用的强度进行动态监测 ［62］ 。SPR由 分析。FP允许全自动高通量分析 ［68］ 。An等 ［69］ 设计
固定化识别分子、分析物分子和光棱镜 3 个主要部 了一个基于荧光偏振的高通量筛选（high through⁃
分组成。固定化分子与传感器芯片表面结合，通过 put screening，HTS）系统来鉴定脂多糖和 Caspase⁃4
棱镜的入射光波激发金属膜中的电子，形成表面等 相互作用的抑制剂。
离子体，当分析物分子缓冲液流过传感器芯片表 2.4 等温滴定量热技术（isothermal titration calori⁃
面，分析物分子结合固定化分子，会引起传感器表 metry，ITC）
面折射率的改变，通过软件检测处理这些信号从而 ITC的原理是通过检测分子相互作用所释放或
得到最终分析结果 ［63］ 。SPR现象因其对表面折射率 吸收的能量，通过单次滴定实验即可提供完整的热
变化的敏感性而受到广泛关注，可用于生物标志物 动力学信息，直接提供结合常数、化学计量比及反
［64］
的高灵敏度检测和快速检测 。 应焓变，揭示蛋白质分子间特异性的相互作用 ［70］ 。
2.3 荧光偏振（fluorescence polarization，FP）技术 滴定前，仪器中的两个量热池（样品池和参比池）的
FP 检测技术是通过分析体系中荧光分子的偏 预设温度相同，两者通过绝热装置隔开。在恒定温
振信号变化差异，实现对分子间相互作用的研究以 度下，加样针以一定速度向样品池中滴加靶蛋白受
及所选目标物的检测 ［65］ 。荧光标记的小分子在溶 体溶液。靶蛋白受体溶液进入样品池后，因样品池
液中快速旋转，在被偏振光激发时，发射光保持去 中的靶蛋白与受体发生相互作用而产生热量变化，
偏振并产生低 FP 信号。当溶液中的荧光小分子与 使体系的温度发生改变，从而导致样品池与参比池
靶蛋白结合成为大分子复合物后，复合物的运动会 之间产生温度差 ［71⁃72］ 。ITC 无需通过荧光标记或固
变慢。当这样的复合体被偏振光激发时，由于复合 定化技术对结合配体进行修饰，实验时间较短、操
体的缓慢运动，大部分发射光被偏振 ［66］ 。反应前后 作简单，且所需样品用量小，灵敏度及精确度高。
荧光偏振的差异与靶蛋白的浓度成比例 ［67］ ，通过荧 Matilla等 ［73］ 使用ITC揭示化学感觉系统的趋化信号
光强度和样品浓度制作工作曲线，就可以进行定量 作用机制，并认为 ITC 是研究结合过程的黄金标