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第44卷第8期 罗 浙，练雷栋，胡珂琦，等. CPO⁃PCL微粒在缺氧条件下对脂肪间充质干细胞体外增殖及成骨
2024年8月 分化作用的影响［J］. 南京医科大学学报（自然科学版），2024，44（8）：1051-1061 ·1053 ·
醇，震荡 30 s 后静置 10 min，重复 3 次，5 000 r/min 清洗。将细胞置于 4%多聚甲醛中固定 30 min 后，
离心 20 min，弃上清液，加入 40 mL 去离子水，震 加入 2 mL 茜素红染色液，染色 10 min，显微镜下观
荡 15 s后静置5 min，如此重复2次，再次5 000 r/min 察染色结果。Image J软件定量茜素红的染色强度，
离心 20 min，弃上清液，所得沉淀经液氮快速冷却， 橘红色复合物越多说明诱导成骨分化越成功。
并冷冻干燥处理4 d，最终得到CPO⁃PCL 微粒。 1.2.7 细胞免疫荧光染色
1.2.2 提取和培养大鼠ADMSC CPO⁃PCL微粒处理的ADMSC用4%多聚甲醛固
无菌条件下，将 SD 大鼠皮肤组织取出，用磷酸 定 10 min，0.5% Triton X⁃100 覆盖 10 min，胎牛血清
缓冲盐溶液（phosphate buffered saline，PBS）洗 3 次， 封闭30 min，再滴加一抗RUNX2抗体、Osteocalcin抗
将皮下脂肪剔下剪碎，置于 0.25%胰酶中 37 ℃震荡 体、Osteopontin 抗体（均 1∶1 000 稀释）覆盖细胞于
消化30 min，800 r/min离心4 min。将沉淀置于0.1% 4 ℃避光12 h。PBS清洗玻片后加入荧光标记的抗兔
Ⅳ型胶原酶中37 ℃震荡消化50 min，200 目细胞筛 IgG（1∶1 000）在室温下孵育 1 h，最后 DAPI 染核
过滤除去纤维组织，800 r/min 离心 4 min，除去上 1 min，防荧光淬灭剂封片观察结果。Image J 软件
清液，用含10%~15%胎牛血清的完全培养基重悬细 定量荧光染色强度。
胞，接种到 25T 培养瓶中，使用大鼠 ADMSC 完全培 1.3 统计学方法
养基（42 mL DMEM/F12 细胞培养基+7.5 mL 胎牛血 采用 SPSS 17.0 统计软件进行处理数据，各组
清+0.5 mL双抗）在37 ℃、5% CO2中培养。大鼠原代 计量资料数据用均数±标准差（x ± s）表示，多组间
ADMSC生长速率较慢，第1代约10 d即生长融合，观 均数比较采用方差分析，以 P < 0.05 为差异有统计
察到较大细胞集落即可传代。 学意义。
1.2.3 微粒对ADMSC的成骨诱导
2 结 果
在 96 孔板里铺 5×10 个/孔 ADMSC 细胞，加入
3
不同浓度（0%、0.10%、0.25%、0.50%和 1.00%）的 2.1 不同浓度CPO⁃PCL微粒对ADMSC体外增殖的
CPO⁃PCL 微粒，分为 4 组，即缺氧成骨分化培养组、 影响
缺氧正常培养组、常氧成骨分化培养组和常氧正常 分别于培养第7天和14天收集各组缺氧或常氧
培养组。 条 件 下 经 不 同 浓 度（0% 、0.10% 、0.25% 、0.50% 、
成骨分化培养使用 ADMSC 成骨分化培养基， 1.00%）CPO⁃PCL 微粒处理的 ADMSC 增殖情况（图
正常培养使用完全培养基，分别培养7、14 d 后收集 1），结果显示，无论在缺氧还是常氧条件下，成骨
细胞进行实验。 分化培养第 7 天，不同浓度的 CPO⁃PCL 微粒均促进
1.2.4 MTT实验 ADMSC 增殖，其中，1.00%的 CPO⁃PCL 微粒促进
分别于培养第 7、14 天采用 MTT 实验检测不同 ADMSC 增殖达到显著水平（P < 0.05）。然而，在培
浓度CPO⁃PCL微粒对ADMSC活力的影响。各组细 养 14 d 后，不同浓度的 CPO⁃PCL 微粒促进 ADMSC
胞接种于 96 孔板中，每孔加入 50 μL 含有 10%胎牛 增殖的能力下降，均未达到显著水平（图2）。
血清的细胞完全培养基，细胞密度为3×10 个/孔。培 2.2 不同浓度CPO⁃PCL微粒对ADMSC中ALP含量
4
养 48 h 后，加入 20 μL/孔 MTT（5 mg/mL）继续孵育 的影响
4 h，弃培养上清液，加入150 μL二甲亚砜（DMSO）振 缺氧成骨分化培养 7 d 条件下，0.10%~1.00%
荡 10 min 溶解沉淀。分光光度计在 490 nm 波长测 CPO⁃PCL 微粒均显著促进 ADMSC 的成骨分化，
量各孔的吸光度值。观察计算各组细胞增殖情况， ALP相对含量增多（P < 0.001）。缺氧正常培养7 d，
实验重复3次。 0.25%和 1.00% CPO⁃PCL 微粒显著促进细胞的成
1.2.5 ALP水平检测 骨分化（P < 0.05）。常氧成骨分化培养 7 d，1.00%
吸弃细胞培养基，PBS清洗，然后加入50 μL显色 CPO⁃PCL 微粒显著促进细胞的成骨分化，ALP 相对
底物，用枪头吹打混匀，37 ℃孵育10 min，然后加入终 含量增多（P < 0.001）。而常氧正常培养，各浓度
止反应液100 μL。Image J软件定量 ALP 染色强度， CPO⁃PCL 微粒均不会促进细胞向成骨方向分化
蓝色沉淀物越多表明成骨分化越好。 （图 3）。
1.2.6 茜素红染色 缺氧成骨分化培养 14 d，随着 CPO⁃PCL 微粒浓
吸去 6 孔板中的成骨诱导分化培养基，用 PBS 度增加，ADMSC中ALP相对含量增多。其中0.25%~
