目的：分离鉴定及分子快速诊断方法确诊布鲁氏菌病，并对2011—2016年间南京地区分离到的布鲁氏菌rpob基因进行特征分析。方法：对疑似布鲁氏菌病患者全血进行分离培养，并通过生化鉴定、Real-time PCR对分离到的布鲁氏菌进行bcsp31基因特异性分析及IS-711插入序列分型。利用PCR方法对rpob基因进行扩增，产物测序并分析。结果：2011—2016年共收集到7株布鲁氏菌，经Real-time PCR方法检测，全部为羊种布鲁氏菌。通过测序分析发现7株羊种布鲁氏菌bpob基因仅出现1个碱基差异。结论：南京地区发现的布鲁氏菌病患者全部为羊种布鲁氏菌感染，羊种布鲁氏菌bpob基因高度同源，在种间水平上显示出良好的多态性。城市地区布鲁氏菌病的传播途径及危险因素更为复杂。