相变液滴（phase⁃change droplet，PCD）是一种在微气泡研究基础上发展起来的具有液⁃气相变能力的诊疗一体化微纳材料^[1]，相变液滴使用具有低溶解度和扩散率的全氟化碳（perfluorocarbon，PFC）作为核心^[2]，使用白蛋白^[3]、表面活性剂^[4]、高分子聚合物^[5]、脂质^[6] 等作为膜壳材料，在其膜壳内外可进一步装载药物、蛋白等活性物质或氧化铁、金等纳米材料，在外界温度、超声、磁场、激光等能量介导下，其内核PFC可由液态转变为气态，从而引起相变液滴结构、尺寸、超声成像能力、释药能力等一系列的变化，赋予其“智能响应”能力。

水凝胶（hydrogel，Hy）是一类通过单体与亲水性基团的物理和化学交联，形成的三维网络结构聚合物^[7]，可用于药物释放、组织工程和生物学研究等，是良好的生物医用材料^[8]。智能响应型水凝胶可以通过单体与交联方式等的改变实现其对pH^[9] 和温度^[10] 等的响应，进而实现逆体积转变或凝胶⁃溶胶转变等。但目前制备智能响应型水凝胶，大多对原材料性能要求较高、成本高、制造工艺相对复杂，且无法控制水凝胶的孔隙数量与尺度、无法引入治疗性气体；与此同时，提高其对外界响应的灵敏度和精准度也是一大挑战。

相变液滴与水凝胶的结合，为水凝胶的智能调控赋予了新的思路，将相变液滴作为中间媒介，通过外部能量场对液滴相转变阈值的精准、联合调控，间接影响水凝胶的结构与性能。这种新思路的优点在于：一方面，相变液滴本身即是一种优良的诊疗一体化载体材料，在增强超声成像、药物/基因可控传递、高/低强度聚焦超声引导下的肿瘤消融等方面极具潜力，相变液滴的引入不仅能赋予水凝胶以上诸多新功能，还可通过对相变液滴的结构设计实现对外界刺激的快速、精确、多重响应；另一方面，这种通过间接响应达到智能调控的思路，降低了对水凝胶单体和制备工艺的要求，且可引入气体、可控制水凝胶的孔隙数量与尺寸，对其结构和力学性能的调控将更加精准。相变液滴与水凝胶复合材料的研究近年来仍然较少报道，主要的研究有：作为细胞培养或组织工程支架，调控细胞的生长迁移或生长因子的释放^[11-12]；作为药物载体，进行局部药物递送等^[13]。

基于以上思路，本研究以脂质作为膜壳材料，以全氟己烷（perfluorohexane，PFH）作为内核，制备出脂质相变液滴（lipid phase⁃change droplet，LPCD），探究其对温度或低强度聚焦超声（low intensity focused ultrasound，LIFU）的响应能力及相变前后的超声造影能力，并将其与光固化型水凝胶进行复合，构建脂质相变液滴⁃水凝胶复合材料（LPCD@Hy），研究温度或LIFU对LPCD@Hy结构、浮力、压缩和溶胀等力学性能的影响。

1 材料和方法

1.1 材料

1，2⁃二棕榈酰⁃sn⁃甘油⁃3⁃磷脂酰胆碱（1，2⁃ dipalmitoyl⁃sn⁃glycerol⁃3⁃phosphatidylcholine，DPPC）、二硬脂酰基磷脂酰乙醇胺⁃聚乙二醇⁃羧基（distearoyl phosphatidylethanolamine polyethylene glycol carboxyl， DSPE ⁃ PEG ⁃ COOH）、全氟己烷（perfluorohexane， PFH）、聚乙二醇二丙烯酸酯[poly（ethylene glycol） diacrylate，PEGDA]和N，N’⁃亚甲基双丙烯酰胺[N， N’⁃methylenebis（acrylamide），BIS]（上海阿拉丁控股集团有限公司）；胆固醇（cholesterol）（上海赛默飞世尔科技中国有限公司）；三氯甲烷和甲醇（上海国药集团化学试剂有限公司）；磷酸盐缓冲液（phosphate buffered saline，PBS）（江苏凯基生物技术股份有限公司）；苯基⁃2，4，6⁃三甲基苯甲酰基膦酸锂（lithium phenyl ⁃ 2，4，6 ⁃ trimethylbenzoyl phosphonate，LAP） （江阴司特易生物技术有限公司）；细胞膜红色荧光探针（1，1’⁃dioctadecyl⁃3，3，3’，3’⁃tetramethylindo⁃ carbocyanine perchlorate，DiI）和细胞膜绿色荧光探针（3，3’⁃ dioctadecyloxacarbocyanine，DiO）（上海碧云天生物科技有限公司）。

1.2 方法

1.2.1 LPCD的制备

采用薄膜水化法^[14] 制备LPCD，将DPPC、胆固醇和DSPE⁃PEG⁃COOH按照5∶1∶0.78质量比溶于有机溶剂中，溶剂由三氯甲烷和甲醇按照9∶1的体积比配备而成，加入50 μL 1mmol/L的DiI或DiO溶液 （DiI或DiO染色LPCD）。40℃旋转蒸发仪（上海贤德实验仪器有限公司）旋转2h后，放入真空干燥箱中过夜，加入30mL PBS缓冲液旋转蒸发仪水化2h。水化后加入300 μL PFH，使用超声波细胞破碎仪（南京先欧仪器制备有限公司）超声5min，功率为130W，得到LPCD。

1.2.2 LPCD的结构和粒径表征

使用光学显微镜（Life Technologies公司，美国） 和扫描电子显微镜（scanning electron microscope， SEM）（JEOL公司，日本）观察LPCD的形貌、大小及膜壳情况。使用粒度仪（Anton Paar公司，奥地利） 测定LPCD在常温下的粒径分布和zeta电位。

1.2.3 LPCD相变温度阈值的确定

使用粒度仪分别测定LPCD在常温、56℃、 60℃、66℃的粒径大小，分析其在核心PFH相转变温度附近的粒径变化。并通过光学显微镜观察相转变前后的形貌变化。

1.2.4 超声对LPCD粒径的调控

制备与人体软组织声阻抗相似的体模，体模中有1个用于注入样品的孔洞，将样品注入体模后，使用低强度聚焦超声（low intensity focused ultrasound， LIFU）（深圳一粟医疗科技有限公司）经体模照射LPCD，观察LPCD液⁃气相变现象。超声探头距离样品约1cm，超声频率为840kHz，输出功率为7.3W，脉冲重复周期为20ms，脉冲持续时间为8ms。在超声时间分别为0、10、15、20min时，光学显微镜下观察LPCD的粒径和形貌的变化。

1.2.5 液⁃气相变对LPCD超声造影能力的影响

将相变前和相变后的LPCD样品注入体模，使用小动物超声成像系统（Visual Sonics公司，加拿大）进行成像，超声探头频率为18MHz，增益为30dB。并通过荧光显微镜（OLYMPUS公司，日本）观察相转变前后的形貌变化。

1.2.6 LPCD@Hy的制备

将PEGDA、LAP、BIS按照摩尔比3.6∶1.7∶1放入LPCD溶液中，加入适量的DiI溶液对整个水凝胶染色（浮力实验），待完全溶解后，取160 μL溶液于模具中，405nm蓝紫光固化15s，得到LPCD@Hy。单纯水凝胶（Hy）的制备方法与LPCD@Hy相似，只需将第一步中的LPCD溶液换成PBS即可。

1.2.7 温度对LPCD@Hy结构的调控

使用荧光显微镜、场发射SEM（FEI公司，美国） 和小动物CT（苏州海斯菲德信息科技有限公司）观察25℃和65℃加热3min后LPCD@Hy的内部结构。

SEM样品制备：将25℃和65℃加热3min后的LPCD@Hy放入西林瓶中冻干，撕成长条状，喷金，观察剖面的孔洞和网络结构。

小动物CT成像参数：X线管扫描条件设置为60kV和133 μA，单次曝光时间为50ms，扫描分辨率为50 μm，扫描角度间隔0.5°。成像后对图像进行三维重建，得到LPCD@Hy的三维立体图。

1.2.8 超声对LPCD@Hy结构的调控

将LPCD@Hy放入盛有PBS的6孔板中，超声探头对准6孔板，和PBS的液面直接接触，探头距离LPCD@Hy约2cm，超声参数与1.2.4相同。在超声时间分别为0、10、30、50、60min时，荧光显微镜下观察水凝胶中LPCD的粒径和形貌的变化。

1.2.9 温度/超声对LPCD@Hy浮力的调控

将Hy和LPCD@Hy装入带有刻度封闭透明玻璃瓶中，65℃水浴加热，观察水凝胶的浮力变化，然后将加热后的水凝胶放入4℃冰箱，观察降温对水凝胶浮力的影响；用LIFU照射Hy和LPCD@Hy，步骤与1.2.6相同，观察LIFU对水凝胶中LPCD的作用，及其引起的水凝胶内部结构和浮力的改变，最后用125W超声初步评估水凝胶中LPCD相变后形成的微气泡破碎所需超声参数。

1.2.10 液⁃气相变对LPCD@Hy机械性能的调控

压缩性能：将Hy和LPCD@Hy制备成直径约10mm，高4mm的圆柱体。样品分为Hy 25℃组、 Hy 65℃组、LPCD@Hy 25℃组、LPCD@Hy 65℃组。使用生物材料力学性能测试系统（MTS公司，美国） 进行压缩，压缩程度为85%，每个样品重复3次。

溶胀性能：通过称重法测量水凝胶的溶胀率，样品分为Hy 37℃组、Hy 65℃组、LPCD@Hy 37℃ 组、LPCD@Hy 65℃组。每隔一段时间取出水凝胶，用湿润的吸水纸擦去水凝胶表面的水，然后用天平称重，得到W_t，待水凝胶溶胀达到平衡后，取出水凝胶冻干，得到干凝胶的重量W₀，计算水凝胶的溶胀率：溶胀率=（W_t-W₀）/W₀×100%。

2 结果

2.1 LPCD粒径和形貌表征

常温时（25℃）LPCD的平均水动力尺寸为165.7nm（图1A），zeta电位为-7.8mV（图1B），说明液⁃气相变前，LPCD处于纳米尺度。这一尺度使其在光学显微镜下很难被观察到（图1C），进一步通过SEM进行表征（图1D），可以清晰地观察到LPCD的空壳结构，在SEM拍摄过程中，由于电子束的作用使得相变液滴内核瞬间汽化，导致LPCD粒径增大，直至膜壳破裂，形成了大量直径在微米量级的空腔结构，这也一定程度上验证了LPCD在外界刺激下的液⁃气相转变能力及相转变所引起的尺度变化情况。

2.2 温度/超声对LPCD粒径的调控

相变液滴的内核成分PFC在环境温度超过其沸点或压力大于汽化阈值时，可以实现从液态到气态的转变。PFH是一种常用的PFC，沸点为56℃，在37℃下相对稳定^[15]，且在重复激活方面表现优异^[16]，因此本研究使用PFH作为LPCD的液态核心。脂质膜壳的包裹通常会对PFH的相转变能力产生影响，改变其发生相转变的阈值温度，通过对常温、56℃、60℃、66℃条件下，LPCD粒径和zeta电位的检测，明确了LPCD的相变温度。

图2A为不同温度下LPCD的粒径分布变化情况，可以看出当温度升高至PFH的相变温度56℃ 时，LPCD的平均水动力尺寸由165.7nm增加至344.1nm，粒径分布出现了双峰，说明此时一部分相变液滴内核发生明显汽化，粒径增加明显形成了微米粒度峰，而另一部分相变液滴内核还未发生明显汽化，粒径稍许增加保持纳米粒度峰；当温度升至60℃ 时，LPCD的平均水动力尺寸增长至1 277.7nm，粒径分布成为单峰，说明此时，绝大部分LPCD的内核均发生了明显液气相变，成为粒径为微米级的脂质微气泡；当温度继续升高至66℃时，LPCD的平均水动力尺寸继续增加为1 380.2nm，而粒径分布又一次出现双峰趋势，这是因为随着温度的进一步升高，内核进一步汽化，导致部分微气泡继续长大甚至破裂，留下粒径较小的微气泡稳定存在，使原来的单峰分化为双峰。图2B为不同温度下LPCD的zeta电位变化情况，表明温度变化不会对其表面zeta电位造成太大影响。光学显微镜下观察，也直观地验证了以上粒径变化的结果（图2C）。以上结果表明，使LPCD发生较完全相变的温度范围在60℃至65℃之间，此时LPCD的粒径会由纳米尺度变化为微米尺度。

温度调控LPCD相变需要将温度升高到PFH的相变点56℃以上，这在体内应用时比较受限。压力的变化也能够引起液滴发生相变，称为声液滴汽化现象（acoustic droplet vaporization，ADV）。超声具有无创、无辐射、成本低等特点^[17-18]，尤其是低强度聚焦超声，在临床上具有较高的应用安全性，可作为声液滴汽化的激励源。图3为LIFU照射0、10、15、 20min时LPCD的光学显微镜图。可以观察到超声照射15~20min时，部分LPCD发生明显相变，粒径显著增加至微米量级。随着超声照射时间的延长，发生液⁃气相转变的LPCD数量逐渐增多。以上实验结果表明，温度/超声调控下LPCD的粒径均能够发生巨大变化，这赋予了LPCD良好的应用潜力。

2.3 液⁃气相变对LPCD超声造影能力的影响

内核液⁃气相变使得纳米级液滴变为微米级气泡，理论上可显著提高其超声造影能力，图4是相变前、后LPCD的体外超声成像结果。可以看出无论是B⁃模式还是造影模式，发生相变之后LPCD的超声图像灰度均高于相变之前（图4A），说明相变液滴液⁃气相转变能够增强超声成像效果。图4B为造影模式下，相变前、后LPCD的平均信号强度随时间变化曲线，可以看出，相变后LPCD的超声图像增强时间可持续4min以上，在造影开始的1min内信号强度最高，之后由于微气泡逐渐发生团聚、破裂等现象，导致超声造影能力逐渐减弱。图4B中也给出了LPCD相变前后的荧光显微镜图片，可以观察出相变前后其形貌的明显变化。

2.4 温度/超声对LPCD@Hy结构的调控

将LPCD与水凝胶复合后，分别对25℃与65℃ 加热3min后的LPCD@Hy结构进行表征，研究液滴相变对水凝胶结构的影响。图5为加热前后， LPCD@Hy的宏观形貌、CT、荧光显微镜和扫描电镜观察结果。可以看出温控下液滴的相变形成的气泡，可以使水凝胶内部形成密集的孔洞，如图5A中白色空泡和图5E中黄色亮点所示，由于水凝胶内部网络结构的限制，孔洞形状大部分呈梭形而非球形 （图5G），直径在几十微米量级，尺寸大于水凝胶自身的空隙结构（图5H）。

虽然温度能够通过调节LPCD相变调控水凝胶的内部结构，但超声是更为有效和实用的方法。前述实验已经证实LIFU能够促使LPCD在水溶液中发生相变，但液滴汽化的声压阈值与周围介质的硬度和黏度有关，因此，本文通过荧光显微镜观察，探究了不同照射时间下LPCD在水凝胶中的相变情况，研究超声调控下液滴相变对水凝胶结构的影响。图6为LIFU照射0、10、30、50、60min时LPCD@Hy的荧光显微镜图。可以观察到，随着照射时间的增长，LPCD在水凝胶中的相变程度不断增大，逐步形成大量百微米量级的气孔。与温度调控相比，超声调控可通过对照射时间和强度的调节，实现在特定的时间和空间位置，对水凝胶结构的更精准和连续调控。上述表征结果证实了相变液滴可以作为中间媒介，通过响应外部温度或超声变化，间接而明显地改变水凝胶的结构。为水凝胶在细胞培养、组织工程和药物递送等方面的应用提供了新思路。

2.5 温度/超声对LPCD@Hy浮力的调控

理论上，LPCD@Hy内部结构的变化会对其性能造成影响。图7A直观地表明液滴相变会引起水凝胶浮力的显著变化，外部温度或超声能量的介导，均无法使未与相变液滴复合的水凝胶Hy浮力发生变化，而与相变液滴复合的水凝胶LPCD@Hy，65℃加热32~42s即开始浮起并最终稳定漂浮于液面上，降温至4℃未明显改变水凝胶在水溶液中的位置，说明降温未对水凝胶的结构和浮力产生明显影响。同样，LPCD@Hy在LIFU照射50min时开始浮起，60min时能够稳定地漂浮在液面上。当增大超声功率至125W照射15min后，LPCD@Hy再次下沉至溶液底部，光学显微镜观察发现125W超声作用前后水凝胶的结构发生了明显变化，超声前水凝胶中存在的大量微米级气泡（图7B），超声作用后气泡消失（图7C），表明调节超声强度和作用时间，不仅可以使水凝胶中的LPCD发生相变，还可以产生破裂。以上结果提示，与LPCD的结合不仅可将气体成分引入水凝胶，还可通过对温度和超声的更细致调控，精准控制水凝胶在溶液或血液中的位置。

2.6 液⁃气相变对LPCD@Hy机械性能的影响

为了对比LPCD液⁃气相变对水凝胶压缩性能和溶胀性能的改变，通过加热的方式使水凝胶中的LPCD发生相转变，因为相比于超声，温度升高时水凝胶受热更均匀，LPCD相转变更完全，水凝胶整体结构的改变更显著。首先，分析了液滴引入对水凝胶压缩性能的影响。图8A中的压缩应力⁃应变曲线表明，未复合相变液滴的水凝胶Hy，升温前后的应力曲线变化不大，说明升温对水凝胶自身的机械性能影响较小。而复合了相变液滴的水凝胶LPCD@Hy，与Hy相比表现出较低的压缩强度，这是因为液滴的加入使得水凝胶的内部有了新的结构单元，交联网络更加不规则，导致凝胶强度降低。另一方面，升温对LPCD@Hy的压缩性能也会产生影响。65℃加热后，在压缩应变为60%时，压缩应力从21.06kPa上升到28.99kPa，而最大压缩应变由71.22%降低到65.44%，这是因为相变液滴在此过程成为微气泡，原本的液态内核成为气态，使凝胶抗压能力增强；而微气泡进一步撑大了水凝胶的网络结构，增加了其结构的不规则度，使其增强硬度的同时降低了韧性。

水凝胶的溶胀率是评价水凝胶性能的重要指标，也在一定程度上影响水凝胶在各方面的应用。图8B中溶胀率随时间的变化曲线表明，未复合相变液滴的水凝胶Hy升温后的溶胀速率和平衡溶胀率大于37℃升温前，说明升温使得水凝胶网络结构变得疏松，对溶胀产生较大影响。而复合了相变液滴的水凝胶LPCD@Hy，与Hy相比，在37℃和65℃都表现出较低的溶胀率，这是因为LPCD在水凝胶网络结构中起一定的支撑和空间占据的作用，导致37℃时水凝胶不容易发生溶胀；另一方面，65℃时LPCD粒径变为微米级，在水凝胶网络结构中占据一定的空间，使得外环境的PBS溶液无法进入水凝胶内部。这也说明LPCD的加入使得水凝胶的网络更加稳定，溶胀性能相对减小。通过4条曲线的对比，可以发现水凝胶的溶胀率在温度较高时表现出一定的退溶胀性质，随后在不同的条件下均随时间逐渐增大至平台期。

3 讨论

相变液滴与智能响应水凝胶均是近年来研究的热点，而将两者结合，设计能够响应外部多种激励的复合水凝胶的研究还鲜有报道。本研究制备了一种温度/超声双重响应型脂质相变液滴，并对其在温度/超声激励下的相转变能力，液⁃气相变前后的超声造影能力进行评估，同时，当其与水凝胶复合后，研究了温度/超声激励下，相变液滴对水凝胶的结构与性能的调控。

在温度和超声调控下，脂质相变液滴能够发生液⁃气相转变，由纳米级液滴蒸发形成微米级气泡。和温度产生的单纯热效应相比，超声能够通过空化作用、机械作用等综合效应刺激液滴发生相变^[19]。相变液滴相转变后能够增强超声造影效果，主要是由于与纳米液滴相比，微米级气泡有更大的散射面积，内核气体也比液体有更大的声阻抗，从而可以有效反射声波。外部激励对相变液滴超声造影能力的调控，一定程度上解决了传统微气泡的应用弊端。外界激励前，PFC核心保持液态，相变液滴粒径处于纳米量级，在血管内有较好的循环稳定性^[20]，且可以通过血管壁扩张进入病变组织，克服了传统微气泡由于微米尺度的限制易被网状内皮系统清除^[21]，无法透过血管进入肿瘤组织内部，从而仅适用于血管造影的不足；外界能量激励之后，纳米液滴转化为微气泡，又克服了纳米尺度造影剂对超声信号的增强作用不足的弊端。

和水凝胶结合后，在温度和超声的调控下，相变液滴同样能够发生液⁃气相转变，在水凝胶内部形成大量孔洞，从而改变水凝胶内部的结构；同时，能够通过调节相变液滴的相变程度控制水凝胶浮力的变化。除此之外，液⁃气相转变会影响水凝胶的机械性能，相变液滴的引入会降低水凝胶的压缩强度，升温后，使水凝胶的硬度增加，韧性下降。本文研究了温度和超声场对相变液滴⁃水凝胶复合材料的调控，但在超声对水凝胶结构性能变化的更精准调控方面，还有待进一步深入。

综上所述，本研究制备了一种温度/超声双重响应型脂质相变液滴，可在温度/超声激励下实现液⁃气相转变，能有效提高相变液滴的超声造影能力，同时，当与水凝胶复合后，通过温度/超声激励，可以间接调控水凝胶的结构与性能。该研究目前尚处于初步阶段，后续将从以下几个方面深入：优化相变液滴的结构，构建适用于体内应用的低沸点相变液滴；对相变液滴进行精准调控，细化超声参数，并探索不同尺寸相变液滴液⁃气相变所需的超声强度阈值；研究水凝胶结构和力学性能的改变对药物释放、组织工程、细胞培养等应用的影响。

参考文献