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通讯作者:

李林海,E-mail:mature303@126.com

中图分类号:R446.7

文献标识码:A

文章编号:1007-4368(2022)08-1119-06

DOI:10.7655/NYDXBNS20220811

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目录contents

    摘要

    目的:建立一种基于 CRISPR/Cas13a 的 TP53 R248W 变异体的快速检测技术。方法:根据 Over⁃lap PCR 技术,以 TP53野生型质粒为模板构建TP53 R248W变异体质粒;对TP53R248W变异体扩增产物大小,扩增反应条件及crRNA长度和浓度进行优化,初步建立基于CRISPR/Cas13a的R248W变异体快速检测方法;利用不同突变率TP53 R248W变异体及模拟血浆 ctDNA,评价 CRISPR/Cas13a 方法的检测灵敏度。结果:建立的 CRISPR/Cas13a 方法成功检测出产物大小为 368 bp 的 TP53 R248W片段;在0.05~0.25 μmol/L浓度范围内,crRNA浓度越高,检测结果相对荧光值越高;该方法检测TP53 R248W变异体的灵敏度为1×104 拷贝/μL,最低可以检测出突变率为0.01%的变异体。结论:建立的CRISPR/Cas13a方法具有快速、简便、灵敏、 特异等优点,为组织和血浆中的TP53 R248W变异体的检测提供了新的技术手段。

    Abstract

    Objective:To establish a CRISPR/Cas13a based method for detecting TP53 R248W mutant molecules. Methods:TP53 R248W mutant plasmid was constructed by Over⁃lap PCR using TP53 wild⁃type plasmid as template. The CRISPR/Cas13a method for the detection of TP53 R248W variant was initially established by optimizing the amplification product size,amplification technology, the length and concentration of crRNA. The sensitivity of CRISPR/Cas13a method was evaluated by TP53 R248W variants with different mutation rates and simulated plasma ctDNA. Results:The size of the amplified product detected by CRISPR/Cas13a was about 368 bp. The concentration of crRNA had influence upon the detection intensity of CRISPR/Cas13a. In the range of 0.05~0.25μmol/L, the higher the concentration of crRNA,the higher the detection intensity of CRISPR/Cas13a was detected. The sensitivity of CRISPR/ Cas13a in detecting TP53 R248W variants was 104 copies/μL,and the minimum mutation rate was 0.01% . Conclusion:The established CRISPR/Cas13a method has the advantages of rapid,simple,sensitive and specific,and provides a new technology for the detection of TP53 R248W variant in tissues and plasma.

    关键词

    CRISPR/Cas13aTP53 R248WcrRNA快速检测

  • 肿瘤蛋白53(tumor protein 53,TP53)是最重要的抑癌基因之一,其编码蛋白P53是胞内关键的转录因子,能够调控P21、Bcl⁃2相关X蛋白(BCL2asso⁃ ciated X,BAX)等多种靶基因的表达水平,广泛参与DNA损伤修复、细胞凋亡、细胞周期调控等多种重要进程[1]。TP53功能获得性突变常导致其抑癌功能的丧失,如R273H、R175H、R248W等,其中R248W突变不仅导致其抑癌功能丧失,还能够促进肿瘤恶性表型和侵袭,导致患者预后较差,而有研究发现阿霉素对携带TP53R248W突变的患者治疗更为敏感[2-3]。因此,对TP53R248W变异体的检测不仅有助于预警肿瘤的发生发展,还能指导肿瘤的治疗和用药。目前,组织和血浆中TP53R248W的检测手段主要有数字PCR、高通量测序、突变扩增系统等。数字PCR准确度高,但成本高,对仪器和操作人员要求高;高通量测序灵敏度高但实验流程复杂;突变扩增系统操作简单但稳定性欠佳,所以亟需寻找一个新的灵敏度高、稳定性好及成本低的肿瘤驱动基因检测方法[4]

  • 成簇的规律间隔的短回文重复序列(clustered regularly interspaced short palindromic repeats,CRISPR) 及其相关蛋白是近年来火爆的研究热点,在RNA干扰和基因编辑等领域有着巨大的潜力[5]。其中, CRISPR相关蛋白13a(CRISPR ⁃ associated protein 13a,Cas13a)是一种新发现的Ⅱ类、Ⅵ型Cas效应蛋白,其活性由高等真核生物和原核生物核苷酸结合 (higher eukaryotes and prokaryotes nucleotide ⁃ bind⁃ ing,HEPN)结构域决定[6]。与 Ⅱ 型Cas9不同, Cas13a属于RNA酶分子,在CRISPR RNA(crRNA) 的引导下,Cas13a结合靶RNA,激活HEPN结构域,从而特异性水解靶RNA及‘连带剪切’周围RNA分子[7⁃8],但当Cas13a/crRNA复合物与非靶RNA结合时,Cas13a的RNA酶特性被抑制[9]

  • 本研究利用Over ⁃ lap PCR技术,构建TP53R248W变异体质粒作为检测对象,设计特异性的靶标crRNA,并根据Cas13a蛋白的‘连带剪切’特性,实现对TP53基因R248W突变的快速检测,以期建立新的、快速、简便以及灵敏的肿瘤驱动基因检测方法,为肿瘤的治疗及监控提供帮助。

  • 1 材料和方法

  • 1.1 材料

  • Cas13a蛋白(M20201)、FAM荧光探针(H2001⁃ 2023)和本研究设计的crRNA购自于广州博徕斯生物公司,所设计扩增引物由威海四合生物公司合成,具体序列见表1。T7转录酶试剂盒(JT101⁃01)、高保真DNA聚合酶(AP231 ⁃ 13)、RNA酶抑制剂 (AI101⁃01)(北京全式金生物)。Top10感受态细胞 (B528412)(上海生工生物工程公司)。RAA试剂盒 (TABAS03KIT)(TwistDx生物公司,英国)。T4连接酶(6022Q)、XhoⅠ限制酶(1094S)及 KpnⅠ限制酶 (1068S)(TaKaRa公司,日本)。血浆DNA提取试剂盒(D3182 ⁃ 03C)(Magen生物公司,美国)。 ABI 9700PCR仪(赛默飞公司,美国)。荧光检测仪(Bio⁃ Rad公司,美国)。TP53野生型质粒、pENTER空载体由本课题组实验室提供。

  • 1.2 方法

  • 1.2.1 TP53 R248W标准品的构建

  • 以野生型TP53质粒为模板,使用TP53⁃F&Rm和Fm&TP53⁃R两对引物分别扩增TP53R248W突变位点前后段序列,使扩增前后段序列均携带有R248W点突变,然后进行重叠(Over⁃lap)PCR将上述两个片段融合。融合产物经限制酶XhoⅠ和KpnⅠ双酶切后,使用T4连接酶将它与pENTER载体进行连接。连接产物转化入Top10细胞,取菌液进行测序鉴定。

  • 表1 突变株的构建引物、RAA引物、crRNA序列和探针序列

  • Table1 Mutant strain primer,RAA primer,crRNA sequence and probe sequence

  • 1.2.2 PCR或RAA扩增TP53 R248W变异体

  • 本研究使用两对扩增引物Primer1(R248W ⁃ RAA⁃F&R248W⁃RAA⁃R1)和Primer2(R248W⁃RAA⁃ F&R248W⁃RAA⁃R2),利用PCR或重组酶介导链置换核酸扩增技术(recombinase aided amplification, RAA)扩增技术,按说明书指导扩增出含TP53R248W突变序列片段。PCR的扩增体系如下: TP53R248W质粒(1 μmol/L)1 μL,前、后引物混合物(10 μmol/L)2 μL,高保真聚合酶混合物25 μL,纯水22 μL。将上述试剂充分混匀后,进行PCR扩增, PCR的扩增程序如下:98℃ 预热5min,然后98℃ 10s,58℃ 15s,72℃ 30s,循环40次,最后72℃ 孵育10min。RAA的扩增体系如下:TP53R248W质粒 (1 μmol/L)1 μL,前、后引物混合物2 μL,RAA反应液29.5 μL,MgCl2 2.5 μL,纯水15 μL。将上述试剂充分混匀后,加入RAA干粉管中,然后39℃孵育20min。

  • 1.2.3 CRIPSR/Cas13a方法对TP53 R248W变异体检测

  • 对步骤1.2.2的扩增产物进行检测,体系如下:扩增产物2 μL,crRNA(1 μmol/L)1 μL,Cas13a蛋白 (10 μmol/L)1 μL,荧光探针(10 μmol/L)1 μL,T7转录酶1 μL,RNA酶抑制剂1 μL,T7buffer(5×)4 μL,NTP 2 μL,无RNA酶纯水补足反应体系至20 μL,混匀后置于Bio⁃Rad CFX荧光检测仪,37℃检测1h,记录各时间段的相对荧光值(relative fluorescence unit,RFU)。

  • 1.2.4 CRIPSR/Cas13a检测体系中crRNA浓度的优化

  • 将crRNA梯度稀释成5个浓度,使检测反应体系中的crRNA终浓度分别为0.05、0.10、0.15、0.20、 0.25 μmol/L。除crRNA外,CRIPSR/Cas13a检测反应体系如步骤1.2.3。

  • 1.2.5 CRIPSR/Cas13a方法对不同突变率TP53 R248W的检测

  • 将浓度为1×103、1×104、1×105、1×106 拷贝数 (copies)/μL的TP53R248W质粒分别与1×107 copies/μL的TP53野生株混合1∶1混合,形成突变频率为0.01%、0.1%、1%、10%,取2 μL混合物进行PCR扩增,然后用上述优化的CRIPSR/Cas13a方法进行检测。

  • 1.2.6 CRIPSR/Cas13a方法对模拟血浆ctDNA的检测

  • 将浓度为1×103、1×104、1×105、1×106、1×107、1× 108 copies/μL的TP53R248W质粒取1 μL分别与1mL经基因检测无TP53突变的人血浆混合,构建TP53R248W突变基因浓度分别为1×100、1×101、1× 102、1×103、1×104、1×105 copies/μL的模拟血浆。使用血浆DNA提取试剂盒,按说明书操作提取模拟血浆ctDNA,取2 μL模拟血浆ctDNA进行PCR扩增,随后使用上述优化的CRIPSR/Cas13a方法进行检测。

  • 1.3 统计学方法

  • 采用SPSS 19.0软件进行统计学分析。计量资料经K⁃S正态性检验,若呈正态分布,采用方差分析或者t检验,若呈偏态分布,采用非参数Mann⁃Whit⁃ ney U检验。计数资料用卡方检验,P< 0.05为差异有统计学意义。

  • 2 结果

  • 2.1 TP53 R248W变异体质粒的构建

  • 根据PCR点突变技术,利用两对携带TP53R248W(C>T)点突变的引物,将TP53野生型序列扩增成前后2个片段,这两片段均含有突变位点序列,以及前段的3′端及后段5′端存在互补序列(图1A),然后使用Over⁃lap PCR将2个基因片段融合成完整的TP53R248W变异体(图1B),经与pENTER质粒连接后转化入Top10感受态,测序结果显示TP53R248W变异体质粒构建成功。

  • 2.2 CRISPR/Cas13a联合PCR或RAA技术检测TP53 R248W突变株

  • 根据TP53R248W变异体序列设计两对扩增引物(Primer 1和Primer 2)。对于Primer 1和Primer 2, PCR和RAA技术均成功扩增出约110bp和368bp的片段(图2A)。使用CRISPR/Cas13a方法检测扩增产物,结果表明,在10min内,各组RFU值均达到平台期,但基于Primer 1扩增的片段,TP53R248W变异体的RFU值与野生型相比无显著性差异(P> 0.05);而基于Primer 2扩增的片段,变异体的RFU值显著高于野生型(P< 0.001,图2B、C)。

  • 2.3 不同浓度crRNA对TP53 R248W变异体检测结果的影响

  • 为了探究不同浓度的crRNA对TP53R248W变异体检测结果的影响,对crRNA进行了梯度浓度稀释,并分别进行CRISPR/Cas13a检测。结果表明,在0.05~0.25 μmol/L范围内,随着crRNA浓度的增加, RFU值也随之增大,其中crRNA浓度达到0.20 μmol/L及以上时,差异具有统计学意义(P< 0.001),表明crRNA浓度的上升会提高TP53R248W变异体的检测强度(图3)。

  • 2.4 CRISPR/Cas13a检测不同突变频率的TP53 R248W

  • 为探究CRISPR/Cas13a方法对不同突变频率的TP53R248W的检测效果,通过按比例混合TP53野生型和R248W变异体质粒,获得了不同突变频率的变异体。以混合质粒为模板,扩增含突变位点的序列片段(图4A)。使用CRISPR/Cas13a技术检测扩增产物,结果显示,不同突变频率的变异体检测结果RFU值显著高于野生型,差异具有统计学意义 (P< 0.05),其中,本研究方法最低可以检测出突变频率为0.01%的混合质粒(含有1×103 copies的变异体),表明TP53基因野生型的存在基本不影响TR248W变异体的检出(图4B)。

  • 图1 TP53R248W突变株构建电泳结果与测序结果

  • Fig.1 The result of electrophoresis and sequencing of TP53R248W mutant strain

  • 图2 Primer1和Primer2扩增产物的电泳结果及CRISPR/Cas13a检测结果

  • Fig.2 The result of electrophoresis and CRISPR/Cas13a for Primer1and Primer2amplification product

  • 2.5 CRISPR/Cas13a对模拟血浆ctDNA的检测

  • 为探究CRISPR/Cas13a技术对模拟血浆ctDNA的检测效果,以模拟血浆ctDNA为模板,扩增含突变位点的序列片段(图5A)。使用CRISPR/Cas13a技术检测扩增产物,结果显示,当血浆中的TP53R248W变异体浓度达到1×104 copies/μL,其RFU值明显高于野生型血浆,差异具有统计学意义(P< 0.01),表明本研究方法最低能检测出模拟血浆中浓度为1×104 copies/μL的TP53R248W变异体(图5B)。

  • 3 讨论

  • Cas13a蛋白在体外具有RNA酶活性,因此,研究者探索了其在病原微生物核酸检测及基因分型中具有潜在的应用价值[10-12]。Gootenberg等[13] 通过对Cas13a蛋白、RNA荧光探针及侧向层析试纸的联合使用,成功对登革热或和寨卡病毒单链RNA进行了检测。Fozouni等[14] 为提高Cas13a蛋白对SARS ⁃ CoV⁃2病毒核酸检测的灵敏度,在同一反应中使用多个crRNA,并且通过一个手持小型设备,实现快速便携地获取结果。Ke等[15] 为降低Cas13a蛋白的脱靶效应,在crRNA的3′末端添加发夹结构,并将改进的技术成功应用在乙肝病毒DNA的分型。本文探究了CRISPR/Cas13a技术可否对多态性核酸(如TP53R248W)进行鉴别,从而为肿瘤驱动基因的检测提供新的帮助。

  • 图3 不同浓度crRNA对CRISPR/Cas13a检测强度的影响

  • Fig.3 The effect of different crRNA concentrations for CRISPR/Cas13a detection

  • 图4 CRISPR/Cas13a对不同突变频率TP53R248W的检测

  • Fig.4 CRISPR/Cas13a detection to different mutation frequency of TP53R248W

  • 图5 CRISPR/Cas13a对模拟血浆ctDNA的检测

  • Fig.5 CRISPR/Cas13a detection to mimic plasma ctDNA

  • 本研究设计了两对扩增引物Primer1和Primer2, 其扩增产物长度分别为110bp和368bp。结果显示CRISPR/Cas13a技术不能检测Primer1的扩增产物, 而可以有效检测Primer2的扩增产物,说明靶RNA长度可能影响CRISPR/Cas13a的的检测效能,推测是较短的靶标RNA与Cas13a/crRNA形成的复合物所获得的自由能不能激活Cas13a的RNA酶活性[15]

  • 为了探究不同扩增方法对CRISPR/Cas13a技术的影响,本研究使用了PCR和RAA两种扩增技术。结果表明CRISPR/Cas13a检测结果没有因扩增方法不同而显示出差异。一般而言,RAA方法不需要专用的仪器,实验时间短,大多30min内可完成扩增,但目前测试价格比较昂贵;PCR需要专用的PCR仪,实验所需时间长,但价格相比RAA便宜[16]。目前,肿瘤驱动基因检查对结果报告时间没有太高的要求,因此扩增技术可以选用更为便宜的PCR方法。

  • 据报道,crRNA的间隔序列在重复序列的3′端,且长度为28nt时,功能发挥最佳[17],因此,本研究的crRNA间隔序列也设计在重复序列的3′端且长度为28nt,并通过CRISPR/Cas13a检测结果证实了这一结论。同时报道称,当crRNA与靶RNA结合出现碱基配对错误时,Cas13a依旧具有RNA酶活性,这对多态性单核苷酸(single nucleotide polymorphism, SNP)的鉴定造成了干扰[18]。因此,本研究将R248W突变碱基设计在crRNA的间隔序列的5′末端,并引入新的错配碱基C,结果发现,当crRNA的间隔序列的5′末端与野生型RNA之间有两个错配碱基,而与变异体RNA之间只有一个错配碱基时,可以有效地区分野生型和变异体。另外,本研究发现crRNA浓度与CRISPR/Cas13a检测强度呈正相关,在0.05~0.25 μmol/L范围内,crRNA浓度越高, CRISPR/Cas13a检测强度越大。

  • 通过混合TP53野生型和R248W变异体,构建了不同突变频率的TP53R248W变异体,结果显示CRISPR/Cas13a方法最低可检出突变频率为0.01%的TP53R248W变异体(1×103 copies),与同类型报道检测的灵敏度相当[13]。最后,通过对模拟血浆ctDNA的检测,发现CRISPR/Cas13a检测方法可以在血浆中检测出浓度为1×104 copies/μL的TP53R248W变异体,为下一步临床样本的检测提供重要依据。

  • 综上所述,本研究建立的CRISPR/Cas13a检测方法能够快速、灵敏且高效地检出TP53R248W变异体,有效区分TP53R248W变异体与TP53野生型,从而为TP53R248W突变肿瘤的诊断及治疗提供极大帮助。另外,本研究建立的方法学也可应用于其他肿瘤驱动基因变异体的检测,从而为肿瘤基因检测提供了新的、多样性的技术手段。

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