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2019 年出现的由新型冠状病毒即严重急性呼吸综合征冠状病毒2型（severe acute respiratory syn⁃ drome coronavirus 2，SARS⁃CoV⁃2）传染引起的新型冠状病毒肺炎（corona virus disease2019，COVID⁃19），在全球暴发并加速扩散流行[1-2]，现已有上亿人感染，死亡数百万人，对社会产生极大影响[3]，给世界各国造成巨大的疾病负担[4]。准确快速开展血清学检测，尽早发现感染者[5-6]，不仅能及时有效治疗患者，还能更有效地进行传染病防控[7-8]。
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我国《新型冠状病毒肺炎防控方案（第八版）》 （联防联控机制综发〔2021〕51号）明确提出：未接种新冠病毒疫苗者新冠病毒特异性免疫球蛋白M（im⁃ munoglobulin M，IgM）抗体和免疫球蛋白G（immuno⁃ globulin G，IgG）抗体均为阳性可判定为确诊病例。建立SARS⁃CoV⁃2抗体的快速定量检测方法是近期 SARS⁃CoV⁃2研究和防控工作的重点。
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1 对象和方法
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1.1 对象
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入组 2020 年 1—2 月江苏省 SARS⁃CoV⁃2 感染逆转录荧光定量 PCR（reverse transcription⁃quantita⁃ tive Real ⁃time PCR，RT ⁃qPCR）检测阳性确诊病例 160例、密切接触者120例的咽拭子与血清，排除其中基本信息登记不全、样本不合格或样本量不足者 （确诊病例4例、密切接触者1例），编盲后检测，记录结果后，揭盲、统计数据。
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1.2 方法
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1.2.1 微流控法
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SARS ⁃ CoV ⁃ 2 微流控法（microfluidic method， MF）IgG/IgM抗体检测试剂盒（天津中新科炬生物制药股份有限公司），荧光免疫分析仪（F10pro）同时检测血清中 IgG 与 IgM 抗体，微流控法通过控制试剂卡内部微量荧光抗原抗体复合物的流动，采集样本中与抗体含量呈正相关的荧光信号，实现对抗体的定量检测[9]。根据产品说明书定量吸取5 μL血清/ 血浆或10 μL全血样本加入到350 μL样本稀释液中，吸取 35 μL 稀释后样本液加入加样孔中，4~20 min 内，沿试剂卡黑色箭头方向，插入荧光免疫分析仪判读结果，仪器分析并记录结果。
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1.2.2 胶体金法
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SARS ⁃CoV ⁃2 胶体金法（colloidal gold method， CG）IgG/IgM抗体检测试剂盒（天津中新科炬生物制药股份有限公司），检测血清中 IgG 与 IgM 抗体，实验步骤与结果判定参照产品说明书。
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1.2.3 荧光RT⁃PCR法（RT⁃qPCR）
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病毒核酸提取试剂提取咽拭子核酸（西安天隆科技有限公司），SARS⁃CoV⁃2 核酸检测试剂盒（荧光 PCR法）（上海伯杰医疗科技有限公司）进行RT⁃qPCR 检测，反应条件体系均按照试剂说明书进行。同时进行RNP基因（内参）检测，合成引物序列。RNP基因检测结果阳性样本为有效结果。有效结果根据上述SARS⁃CoV⁃2核酸检测试剂盒说明书判定结果阴阳性。
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1.3 统计学方法
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应用 Excel 软件对流行病学资料和实验室数据进行录入和管理，资料分析使用 SPSS 22.0 和 Stata14.0软件。阳性率等定性资料通过卡方检验分析；微流控S/CO（标本的吸光度）值等定量资料，当方差不齐时采用非参数检验分析。以核酸检测结果为金标准，统计分析不同检测指标的灵敏度、特异度、Kappa值。P < 0.05为差异有统计学意义。
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2 结果
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2.1 样本情况
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入选 2020 年 1—2 月 SARS⁃CoV⁃2 感染确诊病例（确诊病例）与确诊病例的密切接触者（密接）共 275 例，其中确诊病例 156 例（56.7%），密接 119 例 （43.3%）；男136例（49.5%），女139例（50.5%）；年龄 （40.56±17.44）岁（1~88岁），中位年龄41岁。
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2.2 检测结果
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2.2.1 检测方法比较
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微流控与胶体金检测卡相对于 RT⁃qPCR 检测能力分析见表1。与RT⁃qPCR检测法比较，微流控法 IgM 检测灵敏度与特异度分别是 64.7%、99.2%，微流控法 IgG 检测灵敏度与特异度分别是 98.7%、 100.0%；胶体金法IgM检测灵敏度与特异度分别是 55.7%、100.0%，胶体金法IgG检测灵敏度与特异度分别是96.8%、98.3%。一致性分析发现，微流控法 IgM（Kappa=60.6%）与胶体金法IgM（Kappa=52.2%） 检测与 RT⁃qPCR 检测比较一致性中等；微流控法 IgG（Kappa=98.5%）与胶体金法 IgG（Kappa=94.8%） 检测与RT⁃qPCR检测高度一致。
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2.2.2 COVID⁃19确诊病例IgG、IgM检测结果分析
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本研究中，COVID⁃19确诊病例共156例，男75例 （48.1%），女81例（51.9%）；年龄为（43.52±17.14）岁 （4~77 岁），中位年龄 46 岁；病程为（27.37±11.53）d （0~52 d）；地区分布，苏州84例（53.8%），无锡20例 （12.8%），连云港 52 例（33.3%）；病程分布，病程 < 14 d为发病早中期，23例（14.7%），病程≥14 d为发病后期，133例（85.3%）。
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微流控法检测的 IgG 的 S/CO 值为（24.15 ± 33.37）（0.51~214.03），微流控法检测的 IgM 的 S/CO 值为（1.65±1.33）（0.13~9.76）。以5个临床分型为X 轴，IgG和IgM的S/CO值为Y轴，绘制散点图（图1）。
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COVID⁃19发病早中期，基于微流控法的IgG抗体S/CO值为18.8±7.6，而发病后期为25.1±2.9，差异有统计学意义（Z =-1.98，P =0.048）；根据性别、年龄、临床分型分组计算，仅18~＜45岁年龄组不同病程间IgG抗体S/CO值差异有统计学意义（Z =-2.84，P = 0.005），余根据性别、年龄、临床分型分组比较，不同病程间 IgG 抗体 S/CO 值差异均无统计学意义（表2）。COVID⁃19发病早中期IgG阳性21例（91.3%）， COVID⁃19发病后期IgG阳性为133例（100.0%），差异有统计学意义（χ2 病程=11.72，P =0.001）；且性别、年龄、临床分型分组比较，不同病程间IgG抗体阳性率差异有统计学意义（表3）。
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COVID⁃19 发病早中期，基于微流控法的新冠 IgM抗体S/CO值为1.7±0.2，发病晚期为1.6±0.1，差异无统计学意义（Z =1.08，P =0.281）；性别、年龄、临床分型分组比较差异无统计学意义（表4）。根据病程分组比较，发病早中期 IgM 阳性 19 例 （82.6%），发病后期IgM阳性82例（61.7%），IgM抗体阳性率差异无统计学意义（χ2 =3.77，P =0.052）。根据流行病学信息分组中，仅女性不同病程IgM抗体阳性率差异有统计学意义（χ2 =4.93，P =0.026），余年龄、临床分型分组比较，IgM抗体阳性率差异无统计学意义（表5）。
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图1 不同临床分型的COVID⁃19患者IgG、IgM抗体 S/CO值分布
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Figure1 Distribution of the S/CO values of IgG and IgM antibody for different clinical types of COVID⁃19 cases
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2 讨论
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目前COVID⁃19确诊的主要手段为核酸检测[10]，然而核酸检测仪器设备昂贵、采样人员暴露风险大，采样时间及手法、实验室检测条件等限制容易出现假阴性[11]。且有部分病例，尤其是疫苗接种后又免疫突破的病例，核酸检测常常不能有效检出[12]。因此，COVID⁃19特异性抗体检测不可或缺。
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COVID⁃19抗体定量检测在监测与辅助诊断方面很有意义。一方面，了解 COVID⁃19 患者不同病程抗体滴度变化规律，结合其他症状体征等可能让研究者了解SARS⁃CoV⁃2的更多信息；另一方面，掌握上述规律后，通过检测 COVID⁃19 患者的血清滴度可以提示此患者的感染时间、病程甚至预后等信息。如近期化学发光法血清检测数据提示多数疫苗接种者IgG滴度较低，而免疫突破的COVID⁃19感染者IgG滴度较高，提示接种疫苗后IgG滴度高的被检测者感染 SARS ⁃CoV ⁃2 可能性大（结果另文发表）。此外，定量化的抗体检测可直观体现COVID⁃ 19 患者体内抗体水平，可以辅助诊断 SARS⁃CoV⁃2 感染，可以帮助判断患者病程进展，能监测治疗效果及评价预后[13-14]。
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目前，SARS⁃CoV⁃2抗体常用检测方法包括胶体金法（CGI）、酶联免疫吸附法（ELISA）、化学发光 （CLIA）等[14]，现有 SARS⁃CoV⁃2 抗体定量检测方法主要为化学发光法，但操作复杂，需大型仪器设备，检测时间长（至少2~3 h）。
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微流控法具有需检测样品量小、仪器体积小、能耗低与检测快（数分钟）等特点[15]，是一个新兴的开放式检测平台，应用范围非常广泛，核酸和蛋白质都可以作为目标物质，且蛋白质检测更为成熟[16]。现关于微流控技术的基础研究越来越全面，如抗体固定方法[17]、通道拓扑结构改善[9]、多参数检测研究[15] 等。微流控快速筛查现正式列为前列腺癌筛查的方法之一[18]，还用于检测多种呼吸道病原[19]、肝炎病毒[20] 等病原体，用于临床诊断缺铁性贫血[21]、检测肌钙蛋白确诊心肌损伤[22]、膀胱癌细胞捕获[23]，以及在农产品中检测赭曲霉毒素[24] 等。微流控技术在微型化、多元化、自动化方面不断进展，尤其在生命科学领域发展迅猛，有望成为生命科学的主要研究分析手段之一[25]。
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目前微流控法尚未商品化应用于SARS⁃CoV⁃2 检测。因此，本研究评价了 SARS⁃CoV⁃2 特异性抗体微流控定量检测新方法，期望可以发现一种 SARS⁃CoV⁃2抗体快速定量检测方法，更好适用于现场即时检测（point⁃of⁃care testing，POCT）与临床[12]。
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POCT主要指用便携式分析仪器在采样现场立即得到检测结果的检测方式，以实现快速便捷的临床现场检验为主要目标，具有检测时效性较高、综合成本较低、不依赖专业设备等优势，现已广泛应用于检验检疫、临床监护、家庭保健等领域[16]。POCT 可以使临床诊断和治疗质量得到提升[26]。微流控法所需样本体积小、方便快捷，适用于POCT[27]。
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本研究中，鉴于 COVID⁃19 确诊样本均采集于 2020年1—2月，COVID⁃19疫情初始，患者样本不存在疫苗接种以及多次不同亚型SARS⁃CoV⁃2病毒感染干扰，检测结果阳性即可判定为 SARS⁃CoV⁃2 感染。由于RT⁃PCR 敏感性与特异性均较高，是目前判断受试者是否感染SARS⁃CoV⁃2的标准[28]，SARS⁃ CoV⁃2抗体检测也多以此为检测评价标准[28-30]。本研究中RT⁃PCR与微流控IgG、胶体金IgG检测结果一致性良好。微流控SARS⁃CoV⁃2血清抗体定量检测 IgG 的 S/CO 值范围较大 0.51~214.03（24.15 ± 33.37），IgM范围0.13~9.76（1.65±1.33），但由于病程早期与中期样本的数量较少，仅IgG抗体S/CO值在 COVID⁃19发病早中期比较差异有统计学意义，余分组比较差异均无统计学意义。加大样本量以及免疫突破病例的检测可对COVID⁃19抗体消长规律进行更深入的研究。
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综上，微流控法检测快速方便，应用范围越来越广[31]，可在判定 IgG、IgM 抗体阳性的同时测定抗体浓度滴度，是一种新型抗体滴度检测方法。本研究基于微流控方法定量检测了 SARS⁃ CoV⁃2 感染者的血清抗体，检测结果准确，但仍需进一步扩大样本量，多人群开展验证，以得到更大范围的应用。
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摘要
目的：建立并评价新型冠状病毒即严重急性呼吸综合征冠状病毒2型（severe acute respiratory syndrome coronavirus 2，SARS-CoV-2）特异性抗体定量检测方法，为新型冠状病毒肺炎（corona virus disease-2019，COVID-19）疫情防控提供血清学研判支持。方法：采集2020年1—2月SARS-CoV-2感染者及其密切接触者的血清和咽拭子样本，分别用RT-qPCR法检测SARS- CoV-2核酸，微流控法和胶体金法检测SARS-CoV-2特异性抗体，并比较分析检测结果的一致性。结果：微流控法、胶体金法检测SARS-CoV-2特异性IgG抗体的结果均与RT-qPCR方法一致。发病早中期（<14 d）与后期（≥14 d）微流控法IgG抗体阳性率差异有统计学意义。结论：微流控法是一种新型可定量的SARS-CoV-2抗体检测法，检测结果准确且耗时短。
Abstract
Objective：This study aims to establish and evaluate antibody quantitative detection methods of severe acute respiratory syndrome coronavirus 2（SARS-CoV-2），in order to provide serological data base for corona virus disease-2019（COVID-19）detection and prevention. Methods：The serum and throat swab samples of SARS-CoV-2 infected persons and their close contacts from January to February 2020 were collected，and the SARS-CoV-2 nucleic acid was detected by RT-qPCR，the SARS-CoV-2 specific antibody was detected by microfluidic method and colloidal gold method，respectively，and the consistency of the results was compared and analyzed. Results：The results of detection of SARS - CoV - 2 specific IgG antibody by microfluidic method and colloidal gold method were consistent with those by RT-qPCR，but there were significant differences in IgG positive rates between the early-middle and the late stages by the microfluidic method. Conclusion：As a novel quantitative way to detect SARS-CoV-2 antibodies，the microfluidic method is brief and accurate.