子宫颈癌是女性常见的恶性肿瘤，也是女性癌症死亡的主要原因之一，尤其是在发展中国家和地区^[1]。子宫颈鳞状细胞癌（cervical squamous cell carcinoma，CSCC）是子宫颈癌最常见的组织学亚型^[2]。泛素化是一种重要的蛋白翻译后修饰，通过严格且精准地调控蛋白质稳定性来维持激活信号与抑制信号之间的平衡，参与多种生命活动。泛素化需要 E1 泛素激活酶（E1 ubiquitin⁃activating enzymes，简称 E1）、E2 泛素结合酶（E2 ubiquitin⁃conjugating enzymes，简称 E2）以及 E3 泛素连接酶（E3 ubiquitin ligases，简称 E3）的协同作用。E1 激活泛素后将泛素传递给E2；E3负责底物的特异性识别，可将结合 E2的泛素连接到靶蛋白上^[3-4]。Casitas B细胞淋巴瘤（Casitas B⁃lineage lymphoma，Cbl）蛋白是 E3 大家族中的重要成员，由 c⁃Cbl（又称 RNF55）、Cbl⁃b（又称 RNF56）和 Cbl⁃c（又称 Cbl⁃3、RNF57）组成。有研究报道，Cbl 蛋白家族成员在乳腺癌、肺癌、结直肠癌等肿瘤的发生、发展中发挥重要作用，但因各家族成员之间的结构差异，其在肿瘤中发挥的作用也不同^[5-8]。目前，Cbl 蛋白家族在 CSCC 中的表达及意义仍不清楚。本研究利用免疫组化法检测 c⁃Cbl、Cbl⁃b 和 Cbl⁃c 在 114 例 CSCC 中的表达情况，分析 Cbl 蛋白家族在 CSCC 中的作用及临床意义。

1 材料和方法

1.1 材料

收集2008年6月—2014年8月南通市肿瘤医院病理科确诊的 CSCC 石蜡标本 114 例。患者年龄 29~75 岁，中位年龄 55 岁。114 例患者中无脉管侵犯95例，有脉管侵犯19例。肿瘤高~中分化49例，低分化 65 例。浸润深度<1/3 纤维肌层 47 例，1/3~2/3 纤维肌层 30 例，>2/3 纤维肌层 37 例。肿瘤最大径<4 cm 104例，≥4 cm 10例。无盆腔淋巴结转移 100例，有盆腔淋巴结转移 14 例。FIGO 分期Ⅰ~Ⅱ A 期 100 例，ⅡB~Ⅲ期14例。入选病例样本均为手术标本，患者术前均未接受放、化疗。本研究经本院伦理委员会审核批准（通肿伦审2021⁃086）。

1.2 方法

1.2.1 免疫组化

免疫组化染色采用EnVision法，具体操作步骤按产品说明书进行。c⁃Cbl抗体（货号25818⁃1⁃AP，稀释度 1∶200）、Cbl⁃b 抗体（货号 12781⁃1⁃AP，稀释度 1∶50）（Proteintech 公司，美国）；Cbl⁃c 抗体（货号 sc ⁃390648，稀释度 1∶100）（Santa Cruz Biotechnology 公司，美国）；二抗及 DAB（Dako 公司，丹麦）。用已知阳性组织作阳性对照，PBS 代替一抗作阴性对照。

1.2.2 免疫组化结果判读

免疫组化判读采用组织化学评分法（histochemistry score，H⁃score）。按着色强度：无着色计0分，弱着色计 1 分，中等着色计 2 分，强着色计 3 分。H⁃score= 3 × 强着色细胞百分数 + 2 × 中等着色细胞百分数 + 1 ×弱着色细胞百分数。H⁃score范围为0~300^[9]。采用X⁃tile软件确定c⁃Cbl、Cbl⁃b以及Cbl⁃c高、低表达最佳截断值：将H⁃score <40定义为c⁃Cbl低表达， H⁃score ≥40定义为c⁃Cbl高表达；H⁃score <70定义为 Cbl⁃b 和 Cbl⁃c 低表达，H⁃score ≥70 定义为 Cbl⁃b 和Cbl⁃c高表达。

1.3 统计学方法

应用 SPSS 21.0 对结果进行统计分析。c⁃Cbl、 Cbl⁃b以及Cbl⁃c在CSCC癌组织和癌旁鳞状上皮表达的H⁃Score采用均数±标准差（$\stackrel{-}{x}\pm s$）表示，两组间比较采用 t 检验。c ⁃Cbl、Cbl ⁃b 以及 Cbl ⁃c 表达与 CSCC患者临床病理特征的关系采用Pearson χ² 检验或Fisher精确概率法检验。采用Kaplan⁃Meier 法绘制生存曲线，log⁃rank 法进行显著性检验。单因素和多因素预后分析采用 Cox 风险比例回归模型。 P <0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 c⁃Cbl、Cbl⁃b以及Cbl⁃c在CSCC中的表达及其与患者临床病理特征的关系

c⁃Cbl、Cbl⁃b以及Cbl⁃c主要定位于细胞质，偶可定位于细胞核。114 例 CSCC 患者中，c⁃Cbl 高表达 87 例，低表达 27 例；Cbl⁃b 高表达 69 例，低表达 45 例；Cbl⁃c高表达55例，低表达59例。c⁃Cbl在癌组织和癌旁鳞状上皮H⁃score分别为143.80 ± 8.76、 95.13 ± 6.54，其在癌组织中的表达高于癌旁鳞状上皮（P <0.001）；Cbl⁃b 在癌组织和癌旁鳞状上皮 H⁃score分别为83.95 ± 5.28、93.54 ± 3.91，其在癌和癌旁鳞状上皮中的表达无显著差异（P=0.146）； Cbl ⁃ c 在癌组织和癌旁鳞状上皮 H ⁃ score 分别为 83.62 ± 6.34、36.54 ± 4.64，其在癌组织中的表达高于癌旁鳞状上皮（P <0.001，图1）。c⁃Cbl表达与肿瘤分化（P=0.040）以及肿瘤最大径（P=0.011）相关，其在高~中分化以及最大径 <4 cm 肿瘤中表达较高；但c⁃Cbl表达与患者年龄、脉管侵犯、浸润深度、淋巴结转移以及 FIGO 分期均无关（P 均 >0.05）。 Cbl⁃b表达与浸润深度（P = 0.045）相关，其在浸润深度 >2/3纤维肌层患者中表达较高；但Cbl⁃b表达与患者年龄、脉管侵犯、肿瘤分化、肿瘤最大径、淋巴结转移以及 FIGO 分期均无关（P 均 >0.05）。Cbl⁃c 表达与肿瘤分化（P=0.012）相关，其在低分化肿瘤中表达较高；但Cbl⁃c表达与患者年龄、脉管侵犯、浸润深度、肿瘤最大径、淋巴结转移以及FIGO分期均无关（P均 >0.05，表1）。

2.2 c⁃Cbl、Cbl⁃b以及Cbl⁃c表达与CSCC患者预后的关系

至末次随访，中位随访时间106个月（24~155个月），随访期内 18 例患者出现疾病进展，16 例患者死亡。Kaplan⁃Meier 生存分析显示：c⁃Cbl 高表达患者的无瘤生存期（disease free survival，DFS） 和总生存期（overall survival，OS）比低表达患者延长（P均 <0.05，图2A、B）；Cbl⁃b以及Cbl⁃c表达与患者的 DFS 和 OS 均无关（P 均 >0.05，图2C~F）。Cox 单因素回归分析显示：浸润深度（P=0.037）、淋巴结转移（P=0.010）、FIGO 分期（P=0.010）以及 c⁃Cbl 表达（P=0.022）与DFS相关；浸润深度（P=0.007）、淋巴结转移（P=0.004）、FIGO 分期（P=0.004）以及 c⁃Cbl 表达（P=0.041）与OS相关。将单因素分析有统计学意义的因素纳入Cox多因素回归分析，其中淋巴结转移是 FIGO 分期的参考指标之一，不再纳入多因素分析。Cox多因素分析显示：FIGO分期（P=0.048）以及c⁃Cbl表达（P=0.042）是影响DFS的独立预后因素；FIGO 分期（P=0.034）是影响 OS 的独立预后因素；c⁃Cbl 表达是影响OS的相关因素，但不是OS的独立预后因素（P=0.096，表2）。

^* Pearson χ² 检验；^# Fisher精确概率法检验。

3 讨论

Cbl 蛋白是 E3 大家族中的重要成员，由 c⁃Cbl、 Cbl⁃b和Cbl⁃c组成。Cbl家族3个成员均含有1个高度保守的 N 端酪氨酸激酶结合（tyrosine kinase ⁃ binding，TKB）结构域、1 个连接区（linker region）以及1个环指（ring finger，RF）结构域。TKB结构域由 1 个四螺旋束、1 个钙结合 EF⁃hand 和 1 个变体 SH2 结构域组成，可介导Cbl 蛋白与底物上的磷酸化酪氨酸残基之间的相互作用；RF结构域具有E3活性，可介导泛素从E2转移到底物；连接区含有保守的酪氨酸，对于调节E3活性至关重要^[6，10-11]。Cbl家族3 个成员的C端保守性较低，包含富含脯氨酸（proline ⁃rich，PR）结构域，可介导与SH3结构域蛋白的相互作用。c⁃Cbl 与Cbl⁃b 结构域几乎相同，C端均含有 PR结构域以及泛素相关（ubiquitin associated，UBA） 结构域。与 c⁃Cbl 和 Cbl⁃b 不同，Cbl⁃c 的 C 端缺乏 UBA结构域，且PR结构域长度较短^[5]。Cbl蛋白的主要功能是调节受体和非受体酪氨酸激酶，该过程与免疫受体（T细胞受体、B细胞受体以及Fc受体） 信号的转导有关。有研究报道，Cbl 蛋白可通过泛素化依赖的降解途径负性调节受体和非受体酪氨酸激酶。正常情况下，Cbl 蛋白以非活性状态存在于细胞质中，其催化 RF 结构域被 N 端 TKB 结构域掩盖。当受到刺激时，Cbl 被招募到活化的受体酪氨酸激酶中，导致广泛的酪氨酸磷酸化，诱导构象变化以激活其E3活性^[12]。

有研究报道，c⁃Cbl和Cbl⁃b可通过抑制CD8⁺ T 细胞的活化和自然杀伤细胞的免疫抑制功能阻断免疫系统的抗肿瘤活性，从而加速肿瘤进展^[13]。在乳腺癌中，Cbl⁃b可通过抑制Smad3核转位，抑制转化生长因子⁃β信号通路下游抑癌基因的转录，继而增强肿瘤细胞的侵袭能力^[14]。有研究发现，过表达 Cbl⁃b 可促进 Cbl⁃b 与胰岛素样生长因子 1 受体 （insulin⁃like growth factor 1 receptor，IGF⁃1R）的相互作用，并诱导 IGF⁃1R 的泛素化降解以及 IGF⁃1R 信号失活，进而抑制多药耐药胃癌和乳腺癌细胞的增殖^[15]。本研究发现，c⁃Cbl和Cbl⁃c在CSCC癌组织中的表达高于癌旁鳞状上皮，与其作为原癌基因的身份相符，表明c⁃Cbl和Cbl⁃c在CSCC发生中可能起促进作用。本研究未发现Cbl⁃b在癌和癌旁鳞状上皮中的表达有显著差异。目前研究认为，Cbl 表达异常与肿瘤细胞增殖相关。因此，c⁃Cbl 和 Cbl⁃c 在 CSCC 癌组织中高表达可能介导 CSCC 细胞增殖。 Jing 等^[16] 报道，c⁃Cbl 在高级别胶质瘤中表达较高，且 c⁃Cbl 表达与 WHO 分级以及 Karnofsky 功能状态评分相关。Liu 等^[17] 报道，在乳腺癌中，Cbl⁃b 表达与激素受体以及HER2状态等无关。本研究发现，c⁃Cbl在高~中分化以及最大径 <4 cm肿瘤中表达较高；Cbl⁃b 在浸润深度>2/3 纤维肌层患者中表达较高；Cbl⁃c在低分化肿瘤中表达较高。目前，关于Cbl 蛋白对肿瘤预后价值的报道尚少。Luo 等^[18] 报道，在脊索瘤中，c⁃Cbl以及Cbl⁃b高表达患者的OS和无进展生存期（progression⁃free survival，PFS）较低表达患者显著缩短。而 Kumaradevan 等^[8] 报道，c⁃Cbl 高表达结直肠癌患者的 OS 较低表达患者显著延长。Liu等^[17] 研究发现，Cbl⁃b高表达乳腺癌患者的 OS 和 DFS 较低表达患者延长。本研究发现，c⁃Cbl 高表达 CSCC 患者比低表达患者的 DFS 和 OS 延长 （P 均 <0.05）；Cox单因素和多因素分析显示：c⁃Cbl 表达是影响 DFS 的独立预后因素；c⁃Cbl 表达是影响OS的相关因素，但不是OS的独立预后因素。需要注意的是，“c⁃Cbl 在肿瘤组织中高表达”似乎与 “c⁃Cbl 高表达患者预后好”不符。我们推测，在早期阶段 c⁃Cbl 作为原癌基因可促进肿瘤发生，随后 c⁃Cbl可能通过调控某些特定信号通路调控肿瘤发展，其具体机制有待后续深入研究。本研究未发现 Cbl⁃b 和Cbl⁃c 表达与患者DFS和OS有显著相关性 （P 均 >0.05）。因此，本研究提示，c⁃Cbl 可能成为 CSCC的重要预后预测因子，检测c⁃Cbl的表达状态可为预测CSCC患者的预后提供参考。

参考文献