类风湿关节炎（rheumatoid arthritis，RA）是一种以多关节炎为主要表现的自身免疫性疾病，其特征是慢性滑膜炎症，随着疾病的进展，对关节组织造成破坏，导致关节畸形，影响日常活动^[1-2]。调节性 T细胞（regulatory T cell，Treg）是一群高表达CD25分子的 CD4⁺ T 细胞，研究表明 CD127 在大多数 CD4⁺ CD25 ⁺ Treg 细胞上以低水平表达，CD4、CD25 和 CD127可以作为筛选高度纯化的Treg细胞群的表面标志^[3-4]。既往研究显示，RA受累关节滑液中存在大量Treg聚集，Treg通过抑制自身反应性效应T细胞来控制自身免疫的发生和发展，其功能活性受损导致的免疫紊乱可能是RA的发病机制^[5-6]。CXC趋化因子受体 4（C ⁃X ⁃C motif chemokine receptor 4， CXCR4）是趋化因子配体12（C⁃X⁃C motif chemokine ligand 12，CXCL12）的受体，Treg 表达 CXCR4，并在体外响应其配体迁移。研究表明 CXCR4/CXCL12 信号在调节 Treg 向组织迁移和维持外周 Treg 的稳态中起重要作用^[7]。本研究拟探讨 CD4 ⁺ CD25 ⁺ CD127^- Treg 及CXCR4⁺ Treg 在RA患者外周血及关节滑液中的比例变化，分析 Treg 细胞和 CXCR4 的水平与疾病活动度和炎性指标的关系，现总结报道如下。

1 对象和方法

1.1 对象

RA组51例，为2021年10月—2022年7月在江苏大学附属医院风湿免疫科住院的 RA 患者，其中，男 13 例、女 38 例，年龄（60.78±10.29）岁，病程 0.5~46年，中位病程10（2，17）年，均符合2010年美国风湿病学会/欧洲抗风湿病联盟（ACR/EULAR） 的RA 诊断标准^[8]。骨关节炎（osteoarthritis，OA）组 8例，为同期来本院就诊的原发性膝骨关节炎患者，其中，男3例，女5例，年龄（57.89±11.41）岁，均符合中国骨关节炎诊疗指南（2021年版）中的OA诊断标准^[9]。健康对照（healthy control，HC）组40例，为同期本院健康体检者，其中，男 11 例，女 29 例，年龄 （56.53±10.86）岁，均无相关免疫性疾病和近期感染史。本研究经江苏大学附属医院伦理委员会审核批准（伦理审查号KY2022K1009），且所有研究对象进入研究前签署书面知情同意书。

红细胞裂解液、荧光抗体试剂 CD4 ⁃ PerCP、 CD25 ⁃ APC 和 CD127 ⁃ PE（BD Pharmingen 公司，美国）；CXCR4⁃FITC（Abcam公司，英国）；淋巴细胞分离液（天津灏洋生物）；EasySep^TMCD4正选试剂盒及磁珠分选器（STEMCELL公司，加拿大）；CXCL12蛋白（MedChemExpress 公司，美国）；RPMI 1640 培养基、胎牛血清（Gibco 公司，美国）；Transwell 趋化小室（北京兰杰柯）；流式细胞仪 CANTO10C（BD Pharmingen公司，美国）。

1.2 方法

1.2.1 患者资料收集和分组

收集患者资料，包括临床资料：性别、年龄、病程、28关节疾病活动度评分（disease activity score in 28 joints，DAS28）；实验室资料：血沉（erythrocyte sedimentation rate，ESR）、C 反应蛋白（C ⁃ reactive protein，CRP）、白细胞介素⁃6（interleukin⁃6，IL⁃6）、类风湿因子（rheumatoid factor，RF）、抗环瓜氨酸肽 （cyclic citrullinated peptide，CCP）抗体。按照DAS28 评分将 RA 患者分为缓解组（DAS28 <2.6）、低疾病活动度组（2.6≤DAS28≤3.2）、中疾病活动度组 （3.2 <DAS28≤5.1）和高疾病活动度组（DAS28 >5.1）； 按照RF水平将RA患者分为RF阴性组（RF <20 U/mL） 和 RF 阳性组（RF≥20 U/mL），按照抗 CCP 抗体水平将 RA 患者分为抗 CCP 抗体阴性组（抗 CCP 抗体 <5 U/mL）、5 U/mL≤抗 CCP 抗体 <200 U/mL 组和抗CCP抗体≥200 U/mL组。

1.2.2 外周血CXCR4⁺ Treg的检测

用肝素抗凝负压采血管分别抽取 RA 组及 HC 组静脉外周血，取80 μL全血加入流式上样管，分别加入5 μL CD4抗体、20 μL CD25抗体、5 μL CD127 抗体及2 μL CXCR4一抗混匀，并于4℃、避光条件下孵育30 min；加入1 mL 红细胞裂解液混合均匀，常温避光放置 10 min，1 500 r/min 离心 5 min，弃上清，随后PBS缓冲液洗涤1次，加入100 μL Buffer 缓冲液重悬细胞；加入 0.5 μL CXCR4 二抗混匀，4℃ 避光孵育 20 min；PBS 缓冲液洗涤 2 次，200 μL Buffer 缓冲液重悬并上机检测，每个样本收集 5 000~10 000 个细胞，采用 FlowJo10.0 分析检测数据，记录 CD4⁺ CD25⁺ CD127^- Treg 及 CXCR4⁺ Treg 的百分比。

1.2.3 关节滑液CXCR4⁺ Treg的检测

采用Ficoll密度梯度离心法分离关节液单个核细胞（synovial fluid mononuclear cell，SFMC）。具体方法如下：关节穿刺术抽取 RA 和 OA 组膝关节腔积液5~10 mL，1 500 r/min离心5 min，弃上清，加入 1~2 mL PBS重悬，缓慢加至4 mL淋巴细胞分离液上层，2 500 r/min离心20 min，吸取中间白膜层单个核细胞，PBS 洗涤 2 次（1 500 r/min 离心 5 min），Buffer 缓冲液重悬细胞，调节SFMC浓度为1×10⁷ 个/mL，随后按上述步骤标记细胞表面 CD4、CD25、CD127 及 CXCR4分子，并上机检测CD4⁺ CD25⁺ CD127^- Treg及 CXCR4⁺ Treg的比例。

1.2.4 磁珠分选

采用Ficoll密度梯度离心法分离RA患者和健康人外周血单个核细胞（peripheral blood mononuclear cell，PBMC），按EasySep^TM说明书使用CD4免疫磁珠正选试剂盒分选CD4⁺ T细胞，流式检测CD4⁺ T细胞纯度大于95%，用于后续实验。

1.2.5 Treg迁移测定

使用 CXCL12 作为趋化介质，对纯化的外周血 CD4⁺ T 细胞进行迁移测定。用含有 10%胎牛血清 （FBS）的RPMI 1640重悬CD4⁺ T细胞，将含2×10⁵ 个 CD4⁺ T细胞的100 μL细胞悬液置于Transwell上室，下室加入 600 μL 含 0.1 μg/mL CXCL12 的 RPMI 1640+10% FBS培养液，在37℃、5% CO₂细胞培养箱中孵育 24 h 后收集下室细胞，用 CD4、CD25 和 CD127抗体染色，并通过流式细胞术检测迁移到下室的 Treg 细胞数。流式细胞术检测纯化的外周血CD4⁺ T细胞中CD4⁺ CD25⁺ CD127^- Treg的比例，计算 Treg细胞迁移率：迁移率（%）=迁移到下室的Treg的细胞数/（加入上室的 CD4 ⁺ T 细胞中 CD4 ⁺ CD25 ⁺ CD127^-Treg的比例×2×10⁵）。

1.3 统计学方法

采用 SPSS 25.0 统计学软件分析数据，计量资料满足正态分布时以均数±标准差（$\stackrel{-}{x}$± s）表示，两组间比较采用独立样本 t 检验或配对 t 检验；不符合正态分布时以中位数（四分位数）[M（P₂₅，P₇₅）] 表示，两组间比较采用非参数秩和检验。多组间比较，符合正态分布时采用 F 检验、组间两两比较采用 SNK⁃q 检验，不符合正态分布或方差不齐时采用 Kruskal⁃Walls H 检验、组间两两比较采用 Mann⁃Whitney U检验；相关性分析正态分布资料采用Pearson相关，不符合正态分布的资料用Spearman 等级相关，P <0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 一般临床资料

共纳入RA患者51例，其中，女38例，男13例，年龄（60.78 ± 10.29）岁，病程 0.5~46 年，中位病程 10（2，17）年。OA患者8例，其中，男3例，女5例，平均年龄（57.89 ± 11.41）岁。HC组40例，其中，男 11 例，女 29 例，平均年龄（56.53±10.86）岁，RA 组与 HC 组年龄及性别分布无统计学差异（P >0.05，表1）。

2.2 RA患者外周血CD4⁺ CD25⁺ CD127^-Treg及CXCR4⁺ Treg比例

RA 患者外周血中 CD4 ⁺ CD25 ⁺ CD127^- Treg 占 CD4 ⁺ T 细胞比例为（3.79 ± 1.72）%，低于 HC 组（6.16 ± 1.31）%，差异有统计学意义（P <0.001）； RA 组外周血表达 CXCR4⁺ Treg 占 Treg 细胞比例为（4.08±1.26）%，低于HC组（7.54±1.67）%，差异有统计学意义（P <0.001，图1）。

A：HC组和RA组外周血CXCR4⁺ Treg比例的代表性流式结果；B：HC组（n=40）和RA组（n=51）外周血Treg和CXCR4⁺ Treg的比例。两组比较，^***P <0.001。

2.3 不同疾病活动度RA患者外周血Treg及CXCR4 ⁺ Treg比例

将 RA 患者根据 DAS28 评分分为缓解、低疾病活动度、中疾病活动度和高疾病活动度4组，比较不同疾病活动度患者外周血中Treg比例有无差异，结果显示RA高疾病活动度组外周血Treg比例低于缓解组[（3.01±1.72）% vs.（5.25±2.28）%，P <0.05）]，其他组别之间比较无明显差异（图2A）。随后比较 4 组患者外周血中 CXCR4⁺ Treg 比例有无差异，结果显示高疾病活动度组外周血CXCR4⁺ Treg比例显著低于缓解组[（3.15±0.96）% vs.（5.45±0.77）%， P <0.001]和低疾病活动度组[（3.15±0.96）% vs. （5.39±1.21）%，P <0.001]。此外，中疾病活动度组 CXCR4 ⁺ Treg 比例低于缓解组[（4.17±0.91）% vs. （5.45±0.77）%，P <0.05），其他组别之间比较无明显差异（图2D）。

将RA患者分成RF阳性、RF阴性、抗CCP抗体阴性、5≤抗 CCP 抗体 <200、抗 CCP 抗体≥200 组进行外周血检测，结果显示各组间 RA 患者外周血 Treg以及CXCR4⁺ Treg比例均无明显差异（图2B、C、 E、F）。

相关性分析结果显示RA患者外周血Treg比例以及CXCR4⁺ Treg比例与DAS28评分、CRP、ESR及 IL⁃6水平呈负相关，与病程无明显相关性（图3、4）。

2.4 RA 患者关节滑液 CD4 ⁺ CD25 ⁺ CD127^- Treg 及 CXCR4⁺ Treg比例

RA 患者关节液中 CD4⁺ CD25 ⁺ CD127^- Treg 占 CD4 ⁺ T 细胞比例高于 OA 患者[（11.09±1.54）% vs. （6.22±1.11）%，P <0.001，图5]，RA 患者关节液中 CD4⁺ CD25⁺ CD127^- Treg占CD4⁺ T细胞比例高于OA患者[（11.09±1.54）% vs.（3.31±1.20）%，P <0.001，图6]。

RA 患者关节液中 CXCR4 ⁺ Treg 比例（12.93 ± 2.65）%较 RA 患者外周血（4.29±1.07）%及 OA 患者关节液（6.18±0.98）%均显著增高，差异有统计学意义（P <0.001，图5、6）。

2.5 RA患者外周血Treg的迁移能力

磁珠正选外周血 CD4⁺ T 淋巴细胞后即刻进行流式细胞术检测其纯度，结果显示，纯度达99.55% （图7A）。Transwell 小室实验结果显示，RA 患者外周血 Treg 细胞迁移率显著高于 HC 组外周血 Treg细胞迁移率[（31.26±8.30）% vs.（16.84±5.25）%， P <0.001，图7B、C]。

A：缓解组（n=6）、低疾病活动度组（n=5）、中疾病活动度组（n=22）和高疾病活动度组（n=18）患者外周血中Treg比例；B：RF阳性组（n=18）、 RF阴性组（n=33）患者外周血中Treg的比例；C：抗CCP抗体阴性（n=13）、5~<200 U/mL（n=15）、≥200 U/mL（n=23）患者外周血中Treg的比例； D：缓解组（n=6）、低疾病活动度组（n=5）、中疾病活动度组（n=22）和高疾病活动度组（n=18）患者外周血中 CXCR4⁺ Treg 比例；E：RF 阳性组 （n=18）、RF阴性组（n=33）患者外周血中CXCR4⁺ Treg的比例；F：抗CCP抗体阴性（n=13）、5~<200 U/mL（n=15）、≥200 U/mL组（n=23）患者外周血中CXCR4⁺ Treg的比例。多组均数间两两比较，^* P <0.05，^**P <0.01，^***P <0.001。

A：Treg比例与CRP水平呈负相关；B：Treg比例与IL⁃6的水平呈负相关；C：Treg比例与ESR水平呈负相关；D：Treg比例与DAS28评分水平呈负相关；E：Treg比例与病程无明显相关性。

3 讨论

RA 是以关节滑膜炎为特征的慢性自身免疫性疾病，多种免疫细胞参与了RA的发生和发展^[10-11]，目前认为炎性细胞聚集在 RA 受累滑膜组织，产生大量炎性细胞因子及细胞因子受体，导致滑膜增生和软骨破坏^[12-13]。Treg 细胞又称调节性 T 细胞，大量研究表明，Treg细胞在控制自身免疫反应及维持免疫耐受方面起着关键作用^[14-15]，在系统性红斑狼疮（systemic lupus erythematosus，SLE）及干燥综合征 （Sjogren’s syndrome，SS）患者中均发现有 Treg 细胞的数量及功能的异常，导致机体免疫耐受下降，导致自身免疫反应^[16-17]。既往有研究显示，RA 患者外周血中 Treg 减少^[18-19]，受累关节滑液中 Treg 增加^[20]，但也有部分研究发现 RA 患者外周血 Treg 比例较健康对照外周血无明显差异^[21-22]，可能与标记的Treg细胞表面分子不同有关，也可能与研究所纳入的RA患者治疗方案和疾病活动度不同有关。在本研究中，RA患者外周血CD4⁺ CD25⁺ CD127^- Treg细胞比例明显低于健康对照组，且高疾病活动度组低于缓解组，Treg细胞比例与疾病活动指标DAS28评分、CRP、ESR及IL⁃6水平呈负相关，提示RA患者免疫耐受亦存在缺陷，RA 患者外周血 Treg 细胞比例降低，导致其免疫抑制缺陷，减少对促炎细胞因子的抑制，从而引起关节炎症^[23]，Treg异常参与了RA 的发病机制。课题组进一步研究发现RA患者关节滑液中 CD4⁺ CD25⁺ CD127^- Treg 细胞比例明显高于 OA 患者关节滑液，提示炎症关节大量 Treg 聚集。研究显示关节炎症环境中的Treg细胞可在IL⁃6、白细胞介素⁃1β（interleukin⁃1β，IL⁃1β）和肿瘤坏死因子α（tumor necrosis factor⁃α，TNF⁃α）等因子的驱动下转化为产生促炎因子的辅助性T细胞17（T helper cell17，Th17）^[24]，因此，Treg 表达失衡可能参与了 RA的发病机制。

A：CXCR4⁺ Treg 比例与 CRP 水平呈负相关；B：CXCR4⁺ Treg 比例与 IL⁃6 水平呈负相关；C：CXCR4⁺ Treg 比例与 ESR 水平呈负相关； D：CXCR4⁺ Treg比例与DAS28评分呈负相关；E：CXCR4⁺ Treg比例与病程无明显相关性。

A：OA和RA患者关节液CXCR4⁺ Treg比例的代表性流式图；B：OA组（n=8）和RA组（n=10）关节液Treg和CXCR4⁺ Treg的比例。两组比较， ^***P <0.001。

A：RA患者外周血和关节液Treg的比例；B：RA患者外周血和关节液CXCR4⁺ Treg的比例。两组比较，^***P <0.001，n=10。

A：磁珠正选外周血CD4⁺ T淋巴细胞后进行流式细胞术检测其纯度达99.55%；B：外周血CD4⁺ T细胞进行Transwell试验，流式细胞术检测迁移到下室的CD4⁺ T细胞中CD4⁺ CD25⁺ CD127^- Treg的比例和细胞数的代表性流式结果图；C：RA组（n=15）和HC组（n=10）外周血Treg细胞迁移率的比较。两组比较，^***P <0.001。

为进一步研究RA患者关节液中Treg表达增高的机制，还检测了同一个 RA 患者关节液与外周血，结果发现关节液中 Treg 的比例明显高于外周血，因此推测关节液中 Treg 可能由外周血迁移而来。CXCL12 是由骨髓基质细胞分泌的趋化因子， CXCR4 是其受体，研究表明 CXCL12/CXCR4 轴可以介导细胞的定向迁移，Treg细胞在不同自身免疫病的炎症组织中的积聚可能与CXCR4表达上调有关^[13，25-26]。有研究发现RA患者关节液中CXCL12表达显著高于外周血^[11，27]，但RA患者炎症关节滑液中 Treg 细胞 CXCR4 表达情况的研究较少。Jiao 等^[25] 发现RA患者和健康对照组间外周血Treg上CXCR4 的表达没有明显差异，但关节液中 Treg 细胞上 CXCR4的表达显著增加，与本研究结果相似。本研究中，RA患者关节液中的Treg细胞CXCR4表达水平明显高于 RA 患者外周血及 OA 患者关节滑液。鉴于 CXCR4 可以介导 CD4⁺ T 细胞募集到 RA 的关节滑膜中^[26]，本文推测 RA 患者关节液中 CXCR4 ⁺Treg细胞的增加可能是由于这些细胞从外周血迁移到炎症关节中，外周血中Treg细胞上CXCR4低表达可能是迁移后的结果。为了验证以上推测，进一步使用Transwell迁移试验研究RA患者外周血的Treg 细胞对CXCL12的迁移反应。由于RA患者外周血 Treg细胞比例低于正常对照组，在Transwell体系中上室 CD4⁺ T 细胞数相同的情况下 Treg 细胞数是减少的，迁移到下室的CXCR4⁺ Treg细胞很可能减少，因此用下室 CXCR4 ⁺ Treg 细胞数来判断 RA 患者 Treg细胞对CXCL12的迁移能力可能存在误判。本研究采用迁移到下室的 Treg 细胞占上室 Treg 细胞的比例作为评估RA 患者Treg 细胞对CXCL12的迁移能力。

本研究还发现，与健康对照相比，RA患者Treg 迁移率显著增加，表明 RA 患者外周血 Treg 迁移能力增强，RA患者关节液中CXCR4⁺ Treg细胞的增加很可能是由外周血迁移而来。将进一步研究RA患者关节液中 Treg 细胞的迁移能力，由此深入探讨 RA患者Treg在关节和外周血中的迁移机制。

综上所述，类风湿关节炎患者外周血Treg细胞减少导致其负调控作用减弱，促进了疾病的发生和发展，而RA患者关节滑液中Treg及CXCR4⁺ Treg增加，可能是由于外周血中的 Treg 迁移到炎症关节中，关节液中 Treg 细胞聚集，对控制关节炎症发挥了一定作用，Treg 靶向疗法可能是控制 RA 疾病发展的新的治疗策略。

参考文献