组织工程的引入使骨组织修复技术得到了发展，其中关键要素包括支架、细胞和生物活性因子^[1]，以细胞为基础的颌骨再生技术已经逐步走向了临床^[2]。MC3T3⁃E1 是小鼠颅骨成骨细胞的前体细胞，主要功能是产生骨基质、分泌Ⅰ型胶原、调节骨基质的矿化和破骨细胞的骨吸收等，各种因素导致的成骨细胞活性下降均可引起骨质减少和骨质疏松症的发生^[3]，因此，增加成骨细胞活性是预防和治疗骨缺损疾病的关键之一^[4]。

活性氧（reactive oxygen species，ROS）是正常氧代谢中氧气反应生成水过程的中间产物，在生物体中起到细胞传导和保持机体氧化平衡的作用。但高水平的 ROS 会诱导细胞中包括核酸和蛋白质在内的生物分子氧化，导致细胞功能障碍甚至细胞死亡^[5]。此外，过量产生的H₂O₂会加剧损伤部位的炎症反应，减缓骨缺损的愈合。已有研究发现，ROS 水平升高会抑制间充质干细胞的成骨分化^[6]。因此，需要激活抗氧化酶以防止ROS的过度积累。

然而，天然的抗氧化酶具有制备和提纯工艺复杂、不稳定、易变性、对环境条件要求严苛等缺点，因此人们提出了“人工酶”的概念。2007年，Gao等^[7] 发现四氧化三铁纳米颗粒内在的类过氧化物酶（per⁃ oxidase，POD）活性，首次提出了纳米粒子模拟酶的概念。近几年，普鲁士蓝纳米酶（Prussian blue nano⁃ zyme，PB）由于其出色的模拟酶活性和良好的生物安全性，受到了广泛关注。研究发现，PB具有POD、过氧化氢酶（catalase，CAT）、超氧化物歧化酶（su⁃ peroxide dismutase，SOD）、抗坏血酸氧化镁（ascorbic acid oxidase，AAO）等多种模拟酶活性^[8]。已经有研究把PB 作为天然辣根过氧化物酶（horseradish per⁃ oxidase，HRP）的替代品，应用于纸基比色葡萄糖传感，有效节省了成本，展现出巨大的临床应用价值^[9]。还有研究者利用PB的多酶活性治疗小鼠结肠炎^[10] 和促进皮肤伤口愈合^[11]，均取得了不错的疗效。

本研究在细胞层面初步验证了氧化微环境下 PB的抗氧化促进成骨分化作用，即可以利用PB模拟CAT活性和模拟SOD活性，调节细胞培养微环境中和细胞内的ROS浓度，进而调节细胞成骨分化能力，使受到H₂O₂阳性刺激的细胞的成骨分化能力维持在正常细胞水平，这一理论可以给PB在骨组织工程领域中的应用提供支持。

1 材料和方法

1.1 材料

PVP包裹的PB（南京东纳生物科技有限公司）； 透射电子显微镜（transmission electron microscopy， TEM，FEI Tecnai G2 F30，美国）；扫描电子显微镜 （scanning electron microscope，SEM，TESCAN MAIA3 公司，捷克）；纳米粒度及Zeta电位分析仪（ZS90 NANO 公司，英国）；傅里叶红外光谱仪（Fourier trans⁃ formed infrared，FTIR，Thermo Scientific公司，美国）； 倒置荧光显微镜（Leica 公司，德国）；Spectra Max 190 酶标仪（Molecular device公司，美国）；小鼠颅骨成骨细胞系 MC3T3⁃E1（上海中国科学院细胞库）； 胎牛血清（上海 Cyagen 公司）；α⁃MEM 基础培养基 （Gibco 公司，美国）；MC3T3⁃E1 细胞成骨诱导分化培养基（上海Cyagen公司）；0.25%胰酶（Gibco公司，美国）；磷酸盐缓冲液（phosphate buffered solution， PBS，武汉 Servicebio 公司）；CCK⁃8 试剂盒（合肥 Biosharp 公司）；H₂O₂检测试剂盒（上海碧云天）；总 SOD 活性检测试剂盒（WST ⁃8 法，上海碧云天）； DCFH⁃DA探针（北京Solarbio公司）；ROS试剂盒（北京Solarbio公司）；碱性磷酸酶（ALP）测试盒（上海碧云天）；BCA蛋白定量试剂盒（上海碧云天）；茜素红染色液（上海Cyagen公司）；RNA提取试剂盒（北京天根生化科技有限公司）；RT⁃PCR 逆转录试剂盒、 SYBR Green Premix Ex TaqⅡ（TaKaRa公司，日本）； QuantStudio7荧光定量PCR 仪（ABI公司，美国）；细胞培养箱（Heraeus公司，德国）。

1.2 方法

1.2.1 PB的表征

通过透射电子显微镜观察PB的形态和大小，并通过高分辨率透射电子显微镜观察PB表面晶格；通过扫描电子显微镜观察PB粒径和表面形貌。收集和 PB 溶液一起培养 24 h 的 MC3T3⁃E1 细胞沉淀， 2.5%戊二醛固定制样后透射电镜下观察细胞内结构和PB胞吞情况。

测量PB的紫外⁃可见光吸收光谱（UV⁃VIS），确定PB最大吸收波长；通过纳米粒度及Zeta电位分析仪分析PB的表面电荷和水动力尺寸；傅里叶红外光谱仪获得PB红外吸收光谱（FTIR）。

1.2.2 PB的体外生物相容性

将 MC3T3⁃E1 细胞以每孔 5×10³ 个的密度接种于96孔板中，培养24 h后，加入PB溶液分别使各孔 PB 终浓度为0、10、20、50、100、150 μg/mL，其中，含 0 μg/mL PB 的完全培养基培养的细胞组设置为空白对照组。培养 24 h 和 48 h 后，弃原培养液，每孔加入100 μL的工作液（CCK⁃8与完全培养基按1∶10 混合所得），37℃、5% CO₂恒温培养箱中孵育2 h，每孔吸出80 μL液体至另一块96孔板中，Spectra Max 190 酶标仪测450 nm波长处的吸光度。

将 MC3T3⁃E1 细胞以每孔 1×10⁴ 个的密度接种于12孔板中，24 h后换含0~150 μg/mL不同浓度PB 的培养基继续培养24 h，胰酶消化，收集细胞，用荧光素（FITC、Alexa Fluor488 等）标记的Annexin⁃V和碘化丙啶（propidine iodide，PI）作为探针，流式细胞仪检测细胞凋亡的发生。

1.2.3 PB的体外抗氧化活性

1.2.3.1 PB模拟CAT活性

使用专门的H₂O₂检测试剂盒，通过测定反应混合物中剩余 H₂O₂的浓度来检测 PB 的模拟 CAT 活性。5个1.5 mL的离心管中，加入800 μL 100 μmol/L 浓度的 H₂O₂ 液，再分别加入不同量的 PB 溶液 （250 μg/mL），使终浓度分别为0、10、20、50、100 μg/mL （n=3）。混匀后，在 37℃振荡孵育（100 r/min）。每隔一定时间（15、30、60、90、120 min），从反应混合物中取出溶液 50 μL，按试剂盒说明书使用二甲酚橙法测定剩余H₂O₂浓度。即将50 μL的样品溶液与 100 μL 的 H₂O₂检测液混合，在室温下孵育 30 min，然后用 Spectra Max 190 酶标仪测 560 nm 处的吸光度（D）值。根据先前制作的H₂O₂浓度标准曲线，将 D值转换为H₂O₂浓度。

1.2.3.2 PB模拟SOD活性

使用WST⁃8法，根据总SOD活性检测试剂盒使用说明书，分析PB纳米颗粒的超氧化物清除活性。该测定中，由黄嘌呤/黄嘌呤氧化酶反应系统产生的超氧阴离子，可与WST⁃8试剂反应产生黄色的甲赞产物，使用Spectra Max 190 酶标仪在450 nm处测量该黄色甲赞产物的D值。

超氧化物清除活性=[（D _对照组-D _样本组）/D _对照组]× 100%。

取5个15 mL离心管，按1∶8的比例分别加入不同浓度PB溶液（0、10、20、50、100 μg/mL）和WST⁃8/ 酶工作液。混匀后，在 37℃振荡（100 r/min）孵育。每隔一定时间（30、60、90、120 min），从反应混合物中取出溶液180 μL和20 μL稀释后的反应启动工作液混匀，37℃孵育 30 min，用 Spectra Max 190 酶标仪测定450 nm处的D值（n=3）。

1.2.3.3 PB对细胞内ROS的清除效率

使用DCFH⁃DA荧光探针标记MC3T3⁃E1细胞，倒置荧光显微镜下观察细胞内ROS水平。分组：对照组、PB 组、Rosup 阳性对照组、Rosup+PB 组。将 MC3T3⁃E1细胞以1×10⁵ 个/孔接种于12孔板内，24 h 后，更换无血清的培养基继续培养，其中 PB 组和 Rosup+PB 组加入终浓度为 20 μg/mL 的 PB。24 h 后，Rosup组和Rosup+PB 组加入阳性Rosup试剂刺激细胞15 min，PBS洗3遍，每组细胞均加入预先用无血清培养基配好的 DCFH⁃DA 探针（20 nmol/L）， 37℃避光孵育30 min，倒置荧光显微镜下观察。

MC3T3⁃E1细胞以5×10⁴ 个/孔接种于24孔板内， 24 h 后加入配好的 20 nmol/L 浓度的 DCFH ⁃DA 探针，37℃避光孵育30 min，用PBS洗3遍。随后每孔加入不同浓度的H₂O₂（0、10、25、50、100、200 μmol/L） 刺激细胞。各组分别加入终浓度为 20 μg/mL 的 PB，混匀，避光孵育4 h，测荧光强度（EX=504 nm）。

将 MC3T3⁃E1 细胞以每孔 1×10⁴ 个的密度接种于 12 孔板中，24 h 后一组用不含 PB 的培养基继续培养，另一组用含20 μg/mL PB的培养基继续培养， 24 h后弃原培养基，PBS洗3遍，4%多聚甲醛室温固定30 min，PBS冲洗，0.5% Triton X⁃100 孵育10 min， PBS 漂洗 5 次。加入鬼笔环肽室温条件下染色 20 min，PBS冲洗5次后加入DAPI 室温染30 s，倒置荧光显微镜观察细胞形态。

1.2.4 氧化微环境下 PB 颗粒对 MC3T3⁃E1 细胞的促成骨分化作用

1.2.4.1 ALP染色及活性检测

MC3T3⁃E1 细胞以 1×10⁵ 个/孔的密度接种于 12 孔板中，待其融合至 60%~70%，弃原培养基，加入成骨诱导培养基成骨诱导7 d，2~3 d换液，每次换液都重新加入 H₂O₂和 PB。分组：对照组、H₂O₂组 （200 μmol/L）、H₂O₂+PB（20 μg/mL）组。按ALP显色试剂盒说明书配好染液后，每孔加入 1 mL 染液，室温避光孵育 30 min，PBS 轻洗 2 遍，扫描仪拍照，倒置显微镜下观察。

另取同样成骨诱导 7 d 后的细胞，每孔加入 120 μL 0.5% TritonX⁃100冰上裂解20 min，超声后离心，收集上清液，分别按照BCA总蛋白检测盒和ALP 检测试剂盒的说明书检测总蛋白浓度和ALP活性。

1.2.4.2 茜素红染色

细胞分组和成骨诱导方法同前。成骨诱导21 d 后，吸去原培养基，超纯水轻柔洗涤3次，用4%多聚甲醛在室温下固定细胞30 min。去除固定液，超纯水轻轻洗涤3次，每孔加入茜素红S染液1 mL，室温下染色20~30 min。扫描仪拍照，倒置显微镜下观察。

每孔加入 10% 氯化十六烷吡啶（cetyl pyridini⁃ um chloride，CPC）溶液，待茜素红溶解后，Spectra Max 190 酶标仪测560 nm处D值。

1.2.4.3 实时荧光定量PCR

细胞分组和成骨诱导方法同1.2.4.1。成骨诱导至第 7 天时，弃原培养基，收集细胞，使用 RNA 提取试剂盒分离总 RNA，将其逆转录为 cDNA。采用 TaKaRa SYBR Premix Ex TaqⅡ试剂盒配成10 μL反应体系在QuantStudio7荧光定量PCR仪上进行实时荧光定量PCR，检测成骨分化基因Runt相关转录因子 2（Runt⁃related transcription factor 2，Runx⁃2）、Ⅰ 型胶原蛋白（collagen type⁃Ⅰ，Col⁃Ⅰ）、ALP、骨钙素 （osteocalcin，OCN）的表达。引物由上海生工生物工程有限公司合成（引物序列见表1）。靶基因的相对表达量根据方程式2^-ΔΔCt计算。

1.3 统计学方法

所有定量数据均采用SPSS 22.0 进行统计分析， Graphpad Prism 7进行作图，结果以均数±标准差（$\stackrel{-}{x}\pm s$）表示，组间比较采用单因素方差分析，两两比较采用最小显著性差异法（least⁃significant difference， LSD）检验，P <0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 PB的表征

尺寸和结晶度是纳米材料性能的关键因素。 TEM图像显示，PB为立方体形态的纳米颗粒，直径约为100 nm（图1A）；高分辨率透射电镜图像清晰显示了PB表面晶格条纹（图1B），表明PB具有较好的结晶度；SEM 图像显示 PB 粒径均一，表面呈“颗粒状”，为表面包覆剂 PVP 的存在（图1C）；MC3T3⁃E1 细胞的透射电镜图证实了PB可以被胞吞进入细胞质（图1D），这有利于PB更好地发挥其功能学作用。

20、50、250 μg/mL 的 PB 紫外⁃可见光吸收光谱 （UV⁃VIS）均呈现PB的典型光谱，即由于Fe（Ⅱ）和 Fe（Ⅲ）之间存在价态电荷转移，峰值在 700 nm 左右（图1E）；Zeta 电位平均为-21.8 mV，表面带负电荷（图1F）；水动力平均粒径为 130.9 nm（图1G）； FTIR 光谱图显示了 PB 的结构组成（图1H），处于 2 086 cm^⁃1 的主吸收峰归属于PB中Fe（Ⅱ）-CN-Fe （Ⅲ）中 C≡N 键的伸缩振动，1 639 cm^⁃1 处的吸收峰归属于 PVP 中酰胺基团的 $\mathrm{C}=\mathrm{O}$伸缩振动，表明 PVP 成功包覆于纳米粒子表面，3 443 cm^-1 处的宽吸收峰归属于羟基（O-H），表明 PB 结构中存在间隙水。

2.2 PB的体外生物相容性

将不同浓度的 PB 溶液（0、10、20、50、100、 150 μg/mL）与 MC3T3⁃E1 细胞共培养。CCK⁃8 结果显示，浓度大于 20 μg/mL 之后，细胞活性随着 PB 浓度的增加而减小（图2A）。流式细胞仪检测不同浓度PB（0、10、20、50、100、150 μg/mL）对MC3T3⁃E1 细胞凋亡的影响，也出现相似的趋势，浓度增加到 150 μg/mL 时，正常活性细胞降低到76%，早期凋亡细胞增加到20.7%（图2B）。故后续抗氧化活性实验采用0~100 μg/mL浓度的PB。

2.3 PB在细胞内外的ROS清除活性

2.3.1 PB对细胞外ROS的清除活性

H₂O₂和超氧阴离子是创伤期间细胞中产生的最丰富的活性氧类。通过二甲酚橙法测定分析了 PB的总H₂O₂降解能力。结果表明，PB对H₂O₂的降解具有时间和浓度依赖性（图3A），并且 20 μg/mL PB在作用120 min时，超过50%的H₂O₂已经被降解。

通过测量黄嘌呤/黄嘌呤氧化酶反应系统产生的超氧阴离子来定量PB的超氧化物清除活性。与 H₂O₂降解类似，PB的超氧物清除能力也呈剂量和时间依赖性（图3B），并且20 μg/mL PB在作用120 min 时，也有超过 50%的超氧化物被清除。因此，之后的抗氧化成骨实验，采取20 μg/mL 浓度的PB进行。

2.3.2 PB对细胞内ROS的清除活性

使用DCFH⁃DA荧光探针标记MC3T3⁃E1细胞，倒置荧光显微镜下观察细胞内ROS水平，FTIR荧光越强，代表细胞内 ROS 水平越高。可以看到，正常 MC3T3⁃E1活细胞内的ROS水平很低，加入Rosup阳性刺激的组，FITC 荧光强度显著增强，即细胞内 ROS水平显著提高。而加入20 μg/mL PB不会使细胞内的ROS出现显著上升，相反，PB的存在可以使受到阳性刺激的MC3T3⁃E1细胞内的ROS水平降低（图4A）。

通过酶标仪定量检测了细胞内ROS水平，不同浓度的 H₂O₂ （0、10、25、50、100、200 μmol/L）刺激 MC3T3⁃E1 细胞后，DCF 荧光强度随着 H₂O₂浓度的上升而增高，而 PB 的存在可以明显降低细胞内的 DCF荧光强度即ROS水平，表明PB对细胞内的ROS 也有较好的清除活性（图4B）。

此外，通过鬼笔环肽染色，倒置显微镜下进一步观察了20 μg/mL PB对细胞骨架和结构的影响，荧光图显示20 μg/mL PB的加入对MC3T3⁃E1细胞的骨架和形态无明显改变（图4C）。故采取20 μg/mL浓度的PB进行抗氧化成骨部分的实验。

2.4 氧化微环境下PB对MC3T3⁃E1细胞成骨分化的影响

2.4.1 PB对MC3T3⁃E1细胞ALP活性的影响

为了研究 PB 在氧化微环境下对 MC3T3⁃E1 细胞早期成骨分化的影响，对成骨诱导 7 d 后的 MC3T3⁃E1细胞分别做了ALP染色（图5A）和ALP活性定量检测（图5B）。结果显示，在200 μmol/L H₂O₂ 的阳性刺激下，MC3T3⁃E1细胞的成骨分化能力显著降低，而PB的存在可以增强细胞抗氧化能力，调节氧化微环境，使细胞的成骨分化能力维持正常水平。

2.4.2 PB对MC3T3⁃E1细胞外基质矿化活性的影响

为了研究 PB 在氧化微环境下对 MC3T3⁃E1 细胞晚期成骨分化的影响，对成骨诱导 21 d 后的 MC3T3⁃E1细胞进行了茜素红染色和茜素红半定量检测。结果显示，成骨诱导21 d后对照组和PB组均有矿化物沉积，茜素红染色较深，而200 μmol/L H₂O₂ 阳性刺激组仅可见少量散在红色钙结节，染色也较浅（图6A）。半定量检测结果与染色结果相同（图6 B），表明 PB 对 MC3T3⁃E1 细胞的抗氧化作用可以持续至成骨分化晚期。

2.4.3 PB 对 MC3T3⁃E1 细胞成骨相关基因表达的影响

为了进一步验证氧化微环境下PB对MC3T3⁃E1 细胞成骨的影响，将 3 组 MC3T3⁃E1 细胞成骨诱导 7 d 后，运用实时荧光定量 PCR 分别分析成骨分化基因 Runx⁃2（图7A）、ALP（图7B）、Col⁃Ⅰ（图7C）、 OCN（图7D）的表达。结果显示，除了OCN基因，其余成骨分化相关基因中，H₂O₂组的表达水平明显降低，而PB组的表达水平均高于对照组，差异有统计学意义。OCN基因的表达水平在3组中并未出现显著性变化，可能是该基因在成骨早期表达还不明显。

3 讨论

本研究使用 PVP 包裹的 PB 进行实验，首先对 PB进行表征，结果显示PB为直径约100 nm、表面带负电荷、呈典型立方体形状的纳米颗粒。PVP作为聚合物保护剂可以降低表面能，抑制团聚，并增加纳米颗粒的溶解度。扫描电镜图中可以看到，PB粒径均一，分散性好，未发生团聚。PB的面心立方单元由三价铁离子、亚铁离子和氰化物离子组成，铁离子与氰化物的氮原子相连，而亚铁离子则由氰化物的碳原子相连，交替协调形成一个立方单元^[12]。FTIR 光谱验证了PB中碳氮键的存在。

生物安全性实验显示，浓度在 150 μg/mL 以下的PB生物相容性较好，因此后续抗氧化性实验使用浓度0~100 μg/mL 的PB 进行。细胞TEM 结果显示 PB可以进入细胞内，这有利于PB直接作用于细胞内的ROS，更好发挥其作用。

抗氧化模拟酶实验表明，PB无论对细胞外还是细胞内的ROS都有较好的清除活性，并呈浓度和时间依赖性的方式发挥作用。生物体内最常见的 ROS包括H₂O₂、O₂ ^·- 和·OH，它们是一种细胞内信号分子，当这些 ROS 水平升高，影响细胞信号转导系统，ROS生成与清除失衡，发生氧化应激，生物体各项机能将受到损害^[13]。大多数疾病部位的抗氧化酶水平低于正常组织，ROS水平较高^[14-17]。因此，维持体内 ROS 的动态平衡是机体生存和维持正常代谢活动所必须的^[18]。

由于 120 min 时 20 μg/mL PB 对过氧化物和超氧化物的清除率均超过50%，后续的细胞成骨分化功能实验采用 20 μg/mL 浓度的 PB 进行验证。 MC3T3⁃E1 细胞成骨分化实验结果显示，氧化微环境下，无论在成骨的早期和晚期，PB对细胞的成骨分化均有促进作用。PB抗氧化性的潜在分子机制可能是通过上调磷酸化的核因子红细胞2相关因子 2（nuclear factor erythroid 2⁃related factor 2，Nrf2），以清除 ROS 并抑制核因子κB（nuclear factor kappa⁃B， NF⁃κB）信号通路^[19]。而NF⁃κB信号通路途径中各种成分的缺失均可导致骨骼发育异常，研究也已经证实，NF⁃κB信号转导介导的RANK配体可以诱导破骨细胞生成^[20]。另外，细胞内ROS水平升高可刺激细胞凋亡信号，增加脂肪分化，减少骨髓间充质干细胞的成骨分化。研究报道，细胞内ROS通过激活丝裂原激活蛋白激酶（mitogen⁃activated protein kinase，MAPK）和磷酸肌醇 ⁃ 3 ⁃ 激酶/Akt（phos⁃ phoinositide⁃3⁃kinase/Akt，PI3K/Akt）途径增加间充质干细胞中的胰岛素样生长因子结合蛋白表达，从而降低细胞成骨标志基因如Runx⁃2、OCN的表达^[21]。

综上所述，本研究初步验证了氧化微环境下PB 的抗氧化作用和促进 MC3T3⁃E1 细胞成骨分化作用，但仅仅在细胞层面，PB更深层面的应用还有待研究。此外，PB 的抗氧化和成骨机制也未得到验证。因此，在后续研究中将进一步开发PB的应用价值，如跟骨组织工程支架或者合适的药物缓释体系相结合更好地发挥作用，进行动物实验进一步探讨体内生物安全性以及促成骨作用，并进行机制研究探讨PB作用的相关分子机制，进一步推动PB在骨组织工程中的应用。

参考文献