肌萎缩侧索硬化（amyotrophic lateral sclerosis， ALS）是一种成人致命的神经退行性疾病，涉及皮层、脑干和脊髓的上、下运动神经元进行性丢失，通常在症状出现后的3~5年内因呼吸肌麻痹死亡^[1-2]。ALS 发病机制未明，神经炎症被归为ALS病情发展的重要原因，其中外周免疫系统起到关键作用。有研究表明，ALS患者外周血中的CD4⁺ T淋巴细胞水平降低，其中调节性 T 细胞（T regulatory cell，Treg）的比例与ALS的疾病进展呈负相关^[3]；外周血中CD8⁺ T 细胞的数量变化存在争议，可能与个体变异性有关^[4-6]。然而，外周免疫系统在ALS进展中的具体作用尚不清楚，并且最近发现ALS患者血液和脑脊液中免疫和细胞因子谱的结果并不完全一致^[7-11]。在 ALS小鼠模型中，Treg的减少助长了神经炎症过程，降低了运动神经元的存活率且加速其死亡，被动进行 Treg 细胞输入可抑制神经炎症和延长小鼠存活时间；从ALS患者中分离功能失调的Treg细胞在体外扩增时加入白细胞介素⁃2（interleukin⁃2，IL⁃2）和雷帕霉素刺激可以恢复 Treg 细胞功能^[12]；近日，美国食品药品监督管理局（Food and Drug Administra⁃ tion，FDA）授予一种自体扩增的 Treg 细胞疗法 （ALS001）为ALS的孤儿药。以上提示，Treg细胞有可能为ALS的治疗带来希望。

为了进一步探索外周免疫在 ALS 疾病进展中的作用，本研究选取在体外扩增的自体外周血单核细胞（peripheral blood mononuclear cell，PBMC）回输治疗后短期内临床症状显著改善的ALS患者，观察其在治疗前后不同时间点临床症状与外周血淋巴细胞亚群间的变化关系。细胞亚群方面主要观察了CD4⁺ T细胞、CD8⁺ T细胞、CD4⁺ CD25⁺ Foxp3⁺ Treg 细胞、CD16⁺ CD56⁺ 自然杀伤（natural killer，NK）细胞的数量变化，现将结果报道如下。

1 对象和方法

1.1 对象

本研究选取了2019年10月—2021年8月在南京医科大学附属逸夫医院神经内科和南京中医药大学附属南京医院神经内科诊治的病例，分别来自江苏、安徽、福建、上海、浙江等地，起病年龄32~69岁。所有病例经过至少2名具有3~5年ALS诊疗经验的神经内科主治医师诊断，均严格按照 EI Escorial 诊断标准进行确诊。最终入选65例患者，根据随机表领取随机号码，随机分为两组：接受回输体外扩增自体细胞的PBMC 组（PBMC 1×10⁶ 个/kg体重+20％ 人体白蛋白100 mL，n=33）及对照组（20％人体白蛋白100 mL，n=32）。分别在治疗前和治疗后第5、14天收集每位受试ALS患者的血液各5 mL。此外，记录年龄、性别、疾病分期、体重指数（body mass index， BMI）、疾病持续时间（从第 1 个症状到样本收集日期之间的时间）、修订版ALS功能评定量表（revised ALS functional rating scale，ALSFRS⁃R）分数以及是否使用利鲁唑治疗。本研究经南京中医药大学附属南京医院医学伦理委员会批准（伦理号：2019 ⁃ LS ⁃ ky012），并知情同意，所有方法均按照相关指南和法规进行。整个试验由医院指定的第三方监察员安排、控制。

1.2 方法

1.2.1 PBMC的采集

入组患者需进行五项检测（血常规、尿常规、梅毒抗体、HIV抗体、乙型肝炎五项），确定合格后由医院输血科通过一次性采血袋（内含抗凝剂）采集外周血100 mL，充分混合并于2 h内进行PBMC分离。

在锂肝素管（Sarstedt公司，德国）中收集外周血样本（PBMC 组 15 例和对照组 13 例）。通过 Ficoll⁃ Hypaque（Biochrom 公司，英国）密度离心制备 PBMC，然后用磷酸盐缓冲液（phosphate buffer solu⁃ tion，PBS）洗涤并手动计数^[13]。将用于细胞因子分析的血清样品收集在7.5 mL管中，并在2 000 g下离心 10 min，等分并在收集后 20 min 内在-80℃下冷冻。①稀释：取50 mL离心管，在室温下加入等体积的RPMI 1640培养液（含10%胎牛血清），轻轻吹打混匀；②加样：再取50 mL离心管，用移液管吸取15 mL 淋巴细胞分离液放到离心管里，保持管45°倾斜，把经过稀释的血液于Ficoll液面上方顺着管壁缓慢添加至 Ficoll 上；③ 离心：设置参数 18~20℃，1 500 r/min，20 min（在降速的时候应将刹车关闭），离心后管中液体从管底至液面分4层：依次为红细胞和粒细胞层、分层液层、云雾层（PBMC）、血浆层；④ 回收：在云雾层中插入巴氏管，将其中的云雾层吸出后转入到新离心管中，动作轻柔；⑤洗涤：向其中加入一定量RPMI 1640培养液（至少大于PBMC体积 3 倍，含10%胎牛血清），18~20℃，1 500 r/min，5 min，重复1~2次。

1.2.2 PBMC的体外扩增培养

①激活：将分离成功的 PBMC 接种于 25 cm² 培养瓶中，每个培养瓶中含10 mL RPMI 1640培养液 （含 10%胎牛血清，1%青霉素⁃链霉素），10 μL植物血凝素⁃L（phytohemagglutinin⁃L，PHA⁃L，1.25 μg/mL）， 25 μL IL⁃2（5×10³ U/mL），置于37℃、5%CO₂ 饱和湿度培养箱培养。3 d后离心换液；②扩增：取1/6~1/5 细胞继续培养，余冻存。观察培养状况，每隔3~4 d 以RPMI 1640培养基（含10%胎牛血清，1%青霉素⁃ 链霉素）和IL⁃2（5×10³ U/mL）换液或添加1次，扩增后的原代细胞计数并鉴定。每份（25 cm² 培养瓶）细胞数量为2×10⁷ 个。

FDA已批准对于人体临床试验使用胎牛血清^[14]； 依据现行药典中关于生物制品标准，国内近年来也在临床用细胞培养方面积累了更多经验^[15]。考虑到胎牛血清输入人体后可能会影响患者，回输前的最后 2 次培养将 10％胎牛血清更换为 15％患者本人的自体血清。

1.2.3 体外扩增培养PBMC的自体回输

PBMC体外扩增培养6周后，经含20%人体白蛋白的PBS液洗涤3次，再次进行细胞鉴定及纯度测定，按 1×10⁶ 个/kg 体重取 PBMC 细胞置于 20%人体白蛋白100 mL中，然后装入200 mL输血袋；对照组使用的输血袋装入 100 mL 20%人体白蛋白（安慰剂）用于对照。两组液体在外观、透明度、包装上完全一致。由床位护士直接到输血科领取并在30 min 内输入受试者体内。

1.2.4 质控

出于质控需要，每位受试者在每次回输前均需留存 0.5 mL 液体送检病原微生物（细菌、病毒、真菌）检测及内毒素检测，用同一支20％人体白蛋白 0.5 mL作为阴性对照。

1.2.5 ALSFRS⁃R评分

患者的病情进展由ALSFRS⁃R评估。每位入组患者均由专科医生在治疗前、治疗后第 5 天与第 14 天进行ALSFRS⁃R 评分并记录得分。ALSFRS⁃R 量表总分48分，包括语言、流涎、吞咽、书写、切割食物、着装和卫生、床上翻身、行走、上楼、呼吸困难、端坐呼吸、呼吸功能不全等12个评估项目，得分越低，病情越重。

1.2.6 荧光激活细胞分选（fluorescence activating cell sorter，FACS）的免疫细胞表型

取5 mL新鲜外周血制备的PBMC，采用荧光标记抗 CD3、抗 CD4、抗 CD8、抗 CD14、抗 CD25、抗 CD16、抗 CD56（MiltenyiBiotec 公司，德国）对 T 细胞和NK细胞亚群进行表面染色。阴性对照包括直接标记或未标记的同种型匹配的不相关抗体（BD Bio⁃ sciences 公司，美国）。所有细胞都在 LSR⁃Fortessa （BD Biosciences 公司，美国）上测量，并由FACS⁃Di⁃ va Software（BD Bioscience公司，美国）进行评估。

1.2.7 FACS分析的细胞内染色

为了进一步表征细胞内标志物，将PBMC悬浮在由 RPMI 1640、5%胎牛血清、2 mmol/L L⁃谷氨酰胺、100 U/mL 青霉素和 100 μg/mL 链霉素组成的培养基中。胞内染色前用2 mL PBS（含0.5％Triton）处理细胞 20 min。随后，使用荧光标记的抗 FoxP3 抗体（MiltenyiBiotec 公司，德国）或同种型匹配的不相关抗体（BD Biosciences 公司，美国）对细胞进行染色。染色程序后，通过流式细胞术评估细胞。在LSR ⁃Fortessa（BD Bioscience 公司，美国）上测量细胞，并由FACS⁃Diva Software（BD Bioscience公司，美国）进行评估。

1.3 统计学方法

使用软件程序 GraphPad Prism6.0 和 SPSS 25.0 分析数据。所有数据以均值±标准差（$\stackrel{-}{x}\pm s$）表示。由于样本通过 Shapiro⁃Wilk 检验计算呈正态分布，因此使用配对t检验分别对两组数据进行比较。采用Pearson相关分析，相关系数r值在0.2~0.4为弱相关，0.4~0.6为中等相关，>0.6为强相关。P <0.05为差异具有统计学意义。

2 结果

2.1 安全报告

输注细胞鉴定及纯度测定由南京医科大学药学院协作完成，相关结果在整理发表中，所有入组患者输液后无不良反应且没有治疗相关的不良事件或不良事件导致受试者退出试验。

2.2 研究人群的临床特征

PBMC 组男 22 例，女 11 例；年龄（56.8±9.9）岁； BMI（19.6 ± 3.0）kg/m²；出现临床症状的时间为 （19.98±14.26）个月；有 2 例 ALSⅡ期，17 例 ALSⅢ 期，14 例 ALS Ⅳ期；13 例使用利鲁唑。对照组男 20 例，女 12 例；年龄（58.1±10.1）岁；BMI（21.2± 3.8）kg/m²；出现临床症状的时间为（20.29±14.18）个月；有2例ALSⅡ期，16例ALSⅢ期，14例ALSⅣ期； 12例使用利鲁唑。

2.3 治疗前后ALSFRS⁃R评分的变化

PBMC 组患者 ALSFRS⁃R 评分于治疗后第 5 天 [（30.1±3.4）分]、第14天[（26.5±2.0）分]均较治疗前 [（25.3 ± 1.4）分]升高，差异有统计学意义（P＜ 0.05）。对照组 ALSFRS⁃R 于治疗后第 5 天[（25.5± 1.9）分]、第 14 天[（24.9±1.8）分]与治疗前[（25.3± 1.4）分]比较，差异无统计学意义（P＞0.05，图1）。

2.4 ALS患者PBMC治疗前后淋巴细胞亚群变化

淋巴细胞监测人数根据临床症状改善决定，从两组症状改善明显、症状改善不明显人群中盲选抽取，最后统计时，PBMC组15例，对照组13例接受细胞亚群监测。PBMC 组患者治疗前测得 1 mL 外周血中CD4⁺ T细胞数量为（49.60±21.04）×10⁴ 个，接受 PBMC治疗后第5天细胞数为（54.40±20.66）×10⁴ 个，第14天细胞数为（51.60±20.86）×10⁴ 个；对照组患者治疗前 1 mL 外周血中 CD4 ⁺ T 细胞数量为（49.20± 22.66）×10⁴ 个，接受安慰剂治疗后第 5 天细胞数为（53.80±20.81）×10⁴ 个，第 14 天细胞数为（51.00± 20.59）×10⁴ 个。CD4⁺ T细胞数治疗前、治疗后第5天和第 14 天两组患者间均无明显差异（P＞0.05）；两组患者治疗后第 5 天和第 14 天细胞数与治疗前相比，均无明显差异（P＞0.05，图2A）。

PBMC 组患者治疗前 1 mL 外周血中 CD8⁺ T 细胞数量为（29.20±9.15）×10⁴ 个，接受 PBMC 治疗后第 5 天细胞为（56.20±11.17）×10⁴ 个，第14天细胞数为（40.20±9.76）×10⁴ 个，治疗后第5天、第14天CD8⁺ T 细胞数均有显著升高（P <0.05，图2B）；对照组患者治疗前1 mL外周血中CD8⁺ T细胞数量为（28.60±4.67）× 10⁴ 个，治疗后第5天细胞数为（28.60±2.61）×10⁴ 个，第 14天细胞数为（28.60±5.08）×10⁴ 个，均低于PBMC组 （P <0.05）。

PBMC 组治疗前 1 mL 外周血中 CD4 ⁺ CD25 ⁺ Foxp3 ⁺ Treg 细胞数量为（1.20±0.28）×10⁴ 个，接受 PBMC治疗后第5天细胞数为（15.10±2.01）×10⁴ 个，第 14 天细胞数为（14.40±2.08）×10⁴ 个，治疗后第 5 天、第14天CD4⁺ CD25⁺ Foxp3⁺ Treg细胞数有显著升高（P <0.001，图2C）；对照组治疗前1 mL外周血中 CD4⁺ CD25⁺ Foxp3⁺ Treg 细胞数量为（1.10±0.29）×10⁴ 个，接受对照治疗后第 5 天细胞数为（1.26±0.09）×10⁴ 个，第14天细胞数为（1.24±0.22）×10⁴ 个，均低于 PBMC组（P <0.001）。

2.4.4 PBMC治疗前后CD16⁺ CD56⁺ NK细胞变化

PBMC 组患者治疗前 1 mL 外周血中 CD16 ⁺ CD56 ⁺ NK 细胞数量为（13.20±1.10）×10⁴ 个，接受 PBMC治疗后第5天细胞数为（16.60±2.41）×10⁴ 个，第 14 天细胞数为（15.80±2.86）×10⁴ 个；对照组患者治疗前1 mL 外周血中CD16⁺ CD56⁺ NK 细胞数量为 （12.90±1.56）×10⁴ 个，接受对照治疗后第5天细胞数为（13.00±1.82）×10⁴ 个，第 14 天细胞数为（11.30± 1.74）×10⁴ 个。CD16⁺ CD56⁺ NK细胞数治疗前、治疗后第 5 天和第 14 天两组患者间均无明显差异（P＞ 0.05）；两组患者治疗后第5天和第14天细胞数与治疗前相比，均无明显差异（P＞0.05，图2D）。

2.5 外周免疫细胞表型与ALSFRS⁃R评分相关性

为了评估 ALSFRS ⁃R 评分和 T 细胞亚群变化 （CD8⁺、CD4⁺ CD25⁺ Foxp3⁺ Treg）之间的相关性，本文分析了PBMC组中患者在治疗前、治疗后第5天和第 14天时外周血中CD8⁺ T细胞、CD4⁺ CD25⁺ Foxp3⁺ Treg 细胞数与ALSFRS⁃R评分间的相关性。患者在PBMC 治疗后第5天和第14天时，CD8⁺ T细胞数量与ALS⁃ FRS⁃R分呈负相关，在观察时间内，随外周血中CD8⁺ T细胞数量增加，患者的ALSFRS⁃R分呈下降趋势；在 PBMC治疗后第5天和第14天时，CD4⁺ CD25⁺ Foxp3⁺ Treg细胞数量与ALSFRS⁃R分呈正相关，即随外周血中CD4⁺ CD25⁺ Foxp3⁺ Treg细胞数量增加，患者的ALS⁃ FRS⁃R 分呈上升趋势。PBMC 治疗后第 5 天和第 14 天，CD8⁺ T细胞和CD4⁺ CD25⁺ Foxp3⁺ Treg细胞与 ALSFRS⁃R相关性有统计学意义（P <0.05，图3）。

3 讨论

经体外扩增的自体PBMC回输治疗后短时间内ALS患者临床症状有明显改善，第5天好转最明显，但大部分在 2 周内基本回落到治疗前情况。经 PBMC 治疗后 ALS 患者外周血中 CD8⁺、CD4⁺ CD25⁺ Foxp3⁺ Treg 细胞数较治疗前显著升高，治疗后第 5 天达到峰值；随后患者症状快速回落，治疗后第14 天时，CD8⁺ 细胞数也明显减少但 CD4⁺ CD25⁺ Foxp3⁺ Treg细胞数仍与治疗后第5天时相仿。相关性分析显示，经PBMC治疗后CD8⁺ T细胞数量与ALSFRS⁃ R分数呈负相关，CD4⁺ CD25⁺ Foxp3⁺ Treg细胞数量与 ALSFRS⁃R分数呈正相关。

有研究证明，患者的外周免疫系统在ALS致病过程中起重要作用^[6，16]。CD8⁺ T淋巴细胞在ALS致病及病情进展中的机制尚不明确。动物研究显示，在慢进展 ALS 小鼠中可观察到 CD8⁺ T 细胞浸润而在快进展小鼠中缺乏^[17]。最近有学者提出，CD8⁺ T 细胞在ALS患者中表现出强烈浸润，且激活的小胶质细胞和受损运动神经元中表达的MHC⁃Ⅰ是诱导运动神经元死亡的重要原因^[18]。T淋巴细胞尤其是 Treg细胞，在疾病进展的早期升高，在疾病进展快速阶段下降。此外，ALS缓慢期的Treg会增加抗炎细胞因子水平，并通过IL⁃4、IL⁃10等抑制T细胞功能^[19]。 ALS患者病情的快速进展与Foxp3表达和Treg频率降低有关，恢复Treg数量和功能可能会延缓ALS疾病进展。最新研究表明，ALS患者外周血中Treg细胞明显减少，尤其在快速进展患者中，Tregs中Foxp3 表达下调，Foxp3水平与发病率呈负相关；且Treg细胞数量与ALSFRS⁃R评分呈正相关，较低的Treg计数与较差的ALSFRS⁃R评分和更严重的病程相关^[20]，上述结果与本研究结果一致。

最新研究表明，在 ALS 致病过程中，外周免疫系统（peripheral immune system，PIS）和中枢免疫系统（central immune system，CIS）之间存在交互作用。ALS 患者中的 CIS 普遍存在炎症，小胶质细胞是CIS的固有免疫细胞，通过释放细胞因子和趋化因子等介导神经炎症，在疾病开始时表现出抗炎表型并保护运动神经元，而终末期小胶质细胞则转向促炎表型加重 ALS 患者运动神经元的神经退行性变；星形胶质细胞是大脑最常见的细胞，维持中枢屏障，分泌神经营养和神经保护因子，且可以控制小胶质细胞的激活、迁移和增殖。在 ALS 中，受损的外周淋巴细胞（T淋巴细胞、肥大细胞、单核细胞等）与胶质细胞相互作用，并释放一定水平的细胞因子和趋化因子，如 IL⁃1、IL⁃6、肿瘤坏死因子等。随后，先天和适应性外周免疫细胞聚集渗入中枢神经系统，从而促进炎症。在此过程中，功能失调的中枢神经系统屏障（血脑屏障和血脊髓屏障）细胞旁通透性和渗透性增加，使周围物质和细胞能够进入中枢神经系统，为PIS和CIS“串扰”打开大门，也受到炎症环境的调节，促炎信号从CIS传播到PIS，又从PIS传播到CIS，进而促进了ALS的全身炎症环境^[21]。本研究观察到的经体外扩增的自体PBMC治疗后患者外周血淋巴细胞及临床症状变化可能与上述PIS与CIS之间的“串扰”有关，明确具体哪些机制的作用，需要进一步研究。

本研究仍有很多不足。第一，由于临床条件限制，病例数较少，这可能导致研究结果存在较大误差及偶然现象；第二，PBMC是多种细胞混合物，主要是T细胞，本临床研究中未分特定亚型，无法标记体外扩增的PBMC细胞，输入患者体内后无法分辨检测淋巴细胞中哪些是体外培养后输入，哪些是体内产生；第三，研究中没有同时监测外周血中淋巴细胞分泌细胞因子的表达浓度；第四，现有临床研究大多来自国外报道，其研究病例多数为欧美人种，其与亚洲人种在生理、基因等特征上存在一定差异；第五，在临床试验中缺乏有效判断临床疗效的标记物。

综上所述，本研究显示，体外扩增的自体PBMC 回输治疗，可以短期改善 ALS 患者临床症状，其外周血CD8⁺ T细胞和CD4⁺ CD25⁺ Foxp3⁺ Treg细胞数的变化可能与临床症状改善有关。今后仍需要深入对特定免疫细胞的功能特性进行纵向研究，特别要包括疾病早期阶段患者，以更详细地探索外周先天性和适应性免疫以及整个 ALS 疾病过程中外周免疫与中枢神经系统免疫之间的相互作用。

参考文献