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精子发生包括精原干细胞（spermatogonial stem cells，SSCs）的自我更新、增殖与分化，精母细胞的减数分裂，以及精子细胞变形为成熟精子的过程[1]。 SSCs 的自我更新、增殖与分化调节过程高度有序，维持精子发生源源不断进行。阐明SSCs的分子调控机制是构建人SSCs体外诱导分化体系的理论基础，对于精子发生研究至关重要[2]。然而，由于样本来源以及技术限制等因素，人SSCs亚型种类及其功能研究甚少，相关体外培养及诱导分化研究工作迄今效率不高。因此，迫切需要新方法探索不同SSCs 亚型及其转录组水平与功能变化。
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单细胞转录组测序（single ⁃cell RNA sequenc⁃ ing，scRNA⁃seq）技术是在单细胞水平对全转录组进行扩增与测序的新技术，可以有效捕获睾丸内单个细胞，进行高通量测序分析获取其转录组水平信息。传统的转录组测序研究仅能分析组织中细胞群基因表达平均水平，无法鉴别个体细胞的特异基因表达，因此往往会忽略细胞间的差异。2009年，Tang 等[3] 首次提出单细胞测序技术，在此基础上逐渐演变发展形成多种单细胞测序方案。其主要过程包括细胞悬液样本制备、单细胞捕获、逆转录、cDNA 扩增、文库构建、测序及后续分析[4]。scRNA⁃seq能够精细描述细胞类型、揭示细胞异质性并推测其发育轨迹[5]。因此，scRNA⁃seq独特而强大，可分析睾丸个体细胞转录组特征，在检测数千个甚至更多细胞时，不会忽略细胞间差异，更能代表整个睾丸的细胞组成（图1）。近年来，scRNA⁃seq技术在人睾丸细胞的研究应用不断被报道[6-8]，本文旨在综述单细胞转录组测序技术在人SSCs研究中的应用，以期揭示SSCs亚型种类及其转录组水平和生物学功能变化，为SSCs的机制研究提供理论基础。
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图1 人睾丸scRNA⁃seq分析流程图
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Figure1 Flow chart of human testis scRNA⁃seq analysis
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1 基于scRNA⁃seq技术揭示SSCs起源
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SSCs 起源于原始生殖细胞（primordial germ cells，PGCs），作为精子发生源头维持产生成熟配子。然而，人PGCs 向SSCs 分化这一过程涉及的转录组水平及功能变化仍未完全阐明，scRNA⁃seq 技术有助于认识这一变化过程。
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Guo等[8] 将scRNA⁃seq 鉴定出的成人原始SSCs （stage 0阶段）与婴儿（12~13个月）生殖细胞数据进行降维处理及拟时序分析。结果表明，大部分stage 0阶段的基因标志物（PIWIL4、TSPAN33等）在婴儿生殖细胞中表达上调，发育轨迹上两者位置毗邻，提示该婴儿生殖细胞可能是PGCs演变成SSCs的过渡阶段。后期，该团队进一步对胚胎期（6~8周）、胎儿期（12、15、16 周）和婴儿期（5 个月）睾丸进行 scRNA⁃seq分析，并与前期成人睾丸scRNA⁃seq数据进行比较。在SSCs形成前期过程，共鉴定出2种细胞阶段，包括：①PGCs阶段（存在于胚胎、胎儿期）：特异表达TFAP2C、KIT、NANOG、POUF51、SOX17等基因；②stage f0阶段（存在于胎儿、婴儿期）：特异表达 PIWIL4、EGR4、MSL3、TSPAN33 等基因[9]。该发现与前期 Sohni 等[6] 在婴儿期睾丸 scRNA⁃seq 分析工作中鉴定的 PGCs 及前 SSCs 阶段相吻合。进一步，该团队对两阶段的特异表达基因进行GO注释，发现 PGCs 阶段与信号转导、性腺和干细胞发育等生物学功能有关，在进入胎儿期时，这些功能通路受到明显抑制；stage f0阶段中涉及转录、同源异形的相关基因表达上调，同时，发现SSCs基因标志物开始表达。该团队观察到stage f0至原始SSCs的转变是SSCs基因标志物表达的持续升高，而不是大量新基因的出现，这提示该转变过程可能是 PGCs 分化至SSCs 的过渡阶段。进一步，通过免疫染色实验证明，在胚胎至胎儿阶段，NANOG（PGCs 基因标志物）和MKI67（增殖基因标志物）表达降低；在早期胎儿期，PIWIL4（SSCs基因标志物）被检测出。
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以上表明，PGCs 至原始 SSCs 的转变可能发生于早期胎儿阶段，涉及类多能性、增殖活性等生物学功能的抑制，以及SSCs基因标志物的表达上调，提示在婴儿乃至胎儿阶段，原始 SSCs 雏形逐步形成。同时，鉴定发现特异表达于 PGCs 阶段基因标志物，包括 ETV4、PIM2、POU5F1、PHLDA3、PDPN、 ITM2C、RNPEP和THY1，stage f0（SSCs前阶段）基因标志物，包括 RHOXF1、STK31、CSRP2、ASZ1、SIX1 和THRA。该组基因可能在人PGCs向原始SSCs转化过程中，如SSCs基因标志物的表达调控、多能性抑制等方面起到重要作用，需进一步实验探讨其作用机制。
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2 基于scRNA⁃seq揭示人SSCs亚型及其基因标志物
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基于形态学分析，传统观点认为人精原细胞包括A pale（Ap）、A dark（Ad）、B型精原细胞[10]。Ap和 Ad型精原细胞代表人SSCs的不同阶段，Ad型SSCs 相对静止，Ap型SSCs相对活跃，Ad型精原细胞可进行自我更新或分化为Ap型精原细胞，后者可分化产生B型精原细胞[11-12]。然而，仅依赖形态学方法描述人SSCs是不准确的，有研究使用PAS染色法（pe⁃ riodic acid⁃Schiff stain，PAS）、苏木精伊红染色（he⁃ matoxylin ⁃eosin staining，HE）及免疫组织化学（im⁃ munohistochemistry，IHC）染色结合scRNA⁃seq数据，发现部分 Ap 与 Ad 型精原细胞转录组水平结果相似，提示两者可能为同一细胞类型[13]。因此，需要更精细、准确的方法鉴定、描述人SSCs亚型。
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目前基于scRNA⁃seq 技术，结合已报道精原细胞基因标志物，鉴定出4种精原细胞亚型，包括早期未分化精原细胞（相对静止、SSC⁃1）、晚期未分化精原细胞（相对活跃、SSC⁃2）、分化中精原细胞（早期分化精原细胞）、分化精原细胞[6，8，13-15]。
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Wang等[16] 对scRNA⁃seq 分析获得的SSCs亚群进行研究时，发现 NANOS2、ZBTB16、SALL4、 POU3F1、UTF1、NANOS3高表达于该亚群。进一步分析该SSCs亚群，发现内部存在异质性，对该亚群进行降维处理，鉴定出 2 种不同的 SSCs 表达模式，包括 SSC ⁃ 1：GFRA1low UTF1high（基因标志物：PI⁃ WIL4）；SSC ⁃ 2：GFRA1high UTF1low（基因标志物： ASB9、LITD1），后期Guo等[8] 单细胞测序工作中鉴定发现的SSCs亚群stage 0、1阶段，与其表达模式类似。
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Guo 等[8] 通过 scRNA⁃seq 对未分化精原细胞簇进行聚类分析，发现一种更早期阶段细胞亚群，将其与婴儿生殖细胞转录组进行比较，发现有很大共性。同时，拟时序分析结果表明该亚群与婴儿生殖细胞位置相邻，均位于发育轨迹的起始，提示该精原细胞亚群可能是最原始 SSCs（stage 0 阶段）。其中，stage 0阶段特异表达PIWIL4、EGR4、TSPAN33、 PHGDH、PPP1R36、ICA1L等，早期已鉴定SSCs基因标志物ID4、FGFR3、TCF3 和 UTF1在stage 0、1阶段均表达。通过免疫荧光染色，发现 PIWIL4、PHG⁃ DH、SLC25A22、ICA1L、PPP1R36、MAGEB1、EGR4、 MSL3、TSPAN33 特异表达于 stage 0 阶段，GFRA1、 ETV5、L1TD1 特异表达于 stage1 阶段，KIT、MKI67 特异表达于stage2阶段及分化精原细胞，而UTF1、 FGFR3和TCF3在三阶段均表达。
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Sohni等[6] 通过scRNA⁃seq分析发现2种SSCs亚群，包括早期SSCs（SSC⁃1）及晚期SSCs（SSC⁃2）。分析过程中发现SSC⁃1亚群内部存在异质性，对其进行进一步聚类分析，鉴定发现出3个子亚群，将其命名为 SSC⁃1A、SSC⁃1B 和 SSC⁃1C。拟时序分析揭示其发育轨迹：SSC⁃1B→SSC⁃1A、SSC⁃1C→SSC⁃2，这提示SSC⁃1B可能是原始SSCs。对各阶段基因标志物进行鉴定，SSC⁃1A中包括A2M、ENO3；SSC⁃1B中包括 C19orf84、EGR4、FSD1；SSC ⁃ 1C 中包括 NA⁃ NOS2；SSC⁃2中包括ID4、GFRA1、NANOS3。进一步通过免疫染色验证 EGR4、FSD1、LPPR3、PIWIL4 和 TSPAN33 可作为原始 SSCs（SSC⁃1B）的新型基因标志物，与已知SSCs基因标志物UTF1、GFRA1共染，比较发现 LPPR3、PIWIL4 较 UTF1 可作为原始 SSCs 更特异的基因标志物。同时，利用荧光激活细胞分离技术（fluorescence⁃activatedcell sorting，FACS），发现膜蛋白编码基因 LPPR3 和 TSPAN33 标记志更局限的睾丸细胞群，表明其作为原始SSCs基因标志物的可行性。在Persio等[17] 单细胞测序工作中鉴定类似的SSCs亚群，包括stage 0阶段（PIWIL4、PHDGH、 EGR4）；stage 0A 阶段（UTF1、SERPINE2、FGFR3）； stage 0B（NANOS2）；stage1 阶段（GFRA1、GFRA2、 NANOS3、ID4），其发育轨迹为 stage 0→stage 0A、 stage 0B→stage1。
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综上所述，目前 scRNA⁃seq 研究中鉴定出 4 种SSCs亚型，包括原始精原干细胞阶段SSC⁃0，基因标志物包含 C19orf84、EGR4、FSD1、PHDGH、LPPR3、 PIWIL4和TSPAN33；中间阶段SSC⁃1A与SSC⁃1B，基因标志物包含 A2M、ENO3、UTF1、SERPINE2、FG⁃ FR3 和 NANOS2；晚期精原干细胞 SSC⁃2，基因标志物包含GFRA1、GFRA2、NANOS3、ID4。这些基因标志物的发现，有助于鉴定不同SSCs亚型，并推测各亚型可能的生物学功能。然而，鉴于个体之间遗传差异，不同研究结果有所偏差。同时，各基因标志物的表达定位及作用功能需进一步验证、阐明。
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3 基于 scRNA⁃seq 探索人 SSCs 自我更新、增殖与分化调控机制
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SSCs 通过自我更新保持自身细胞群数量的恒定，对于生育力维持至关重要。Hermann等[14] 聚焦于人、小鼠SSCs亚群，scRNA⁃seq分析发现神经营养因子 GDNF 均表达上调，并促进 EIF2、mTOR 和 p70S6K 的翻译，这可能是一种驱动 SSCs 自我更新转录本选择性翻译的机制。小鼠研究中，GDNF 通过作用于未分化精原细胞上的RET 酪氨酸激酶，对 SSCs的自我更新起到重要作用[18]。在Wang等[16] 研究中，GO注释发现SSCs亚群富集于“基因表达的负调控”和“细胞生物合成过程的负调控”等生物学功能过程，表明该亚群细胞状态相对静止。基于 scRNA⁃seq 数据，发现成纤维细胞生长因子（fibro⁃ blast growth factor，FGF）相关受体 FGFR1、FGFR2、 FGFR3高表达于未分化精原细胞中，FGF在维持SS⁃ Cs 自我更新上起到重要作用。其中，FGF8⁃FGFR1 信号可能通过激活ERK1/2信号通路来维持SSCs自我更新[19]；FGF 可通过激活 MAPK2K1、ERK 和 Akt 通路信号，维持SSCs自我更新[20]。同时，研究发现 FGF在人SSCs体外长期培养中起重要作用，是SSCs 体外培养基的关键组分[21]。研究发现骨形态发生蛋白（bone morphogenetic protein，BMP）信号相关成员特异表达于SSCs，包括：BMPR1B、BMP7、BMPR2、 SMAD1、SMAD5、SMAD9，其中BMPR1B特异表达于 SSCs，对BMPR1B+ SSCs细胞亚群染色发现，磷酸化的SMAD1/5/9、ID1和ID4蛋白表达阳性，表明在SS⁃ Cs中BMP通路激活[22]。小鼠研究中，BMP通路在调节小鼠精原细胞未分化状态中起到重要的作用。 BMP4、BMP7和BMP8B已被证明可诱导人类胚胎干细胞产生早期生殖细胞[23]。以上结果表明，GDNF、 FGF和BMP通路在参与维持人SSCs 的自我更新上可能起到重要作用。然而迄今为止，人 SSCs 的体外培养研究仍进展缓慢，睾丸单细胞测序鉴定出的基因标志物有望推动这一进展，但仍需进一步的体内实验去证实。
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SSCs的增殖与分化作为精子发生起始步骤，细胞状态由相对静止向增殖活跃转化，产生定向分化的精原细胞，使精子发生源源不断进行。Hermann 等[14] 利用scRNA⁃seq 技术平行比较、研究人和小鼠睾丸转录组特征，发现参与肝星状细胞活化通路的基因包括 BCL2、EDNRA、KLF6、PDGFRA 和 TGF 在 SSCs 亚群中表达逐渐上调。该通路的激活使靶细胞对相关诱导性细胞因子信号产生反应[24]，表明从静止的SSCs到分化精原细胞的转变涉及对细胞因子信号的反应。Sohni 等[6] 发现未分化精原细胞至分化精原细胞阶段，促细胞增殖的相关基因 CCND2、SPRY1等表达上调，GO注释发现分化精原细胞特异表达基因富集于细胞增殖相关通路，与其增殖功能活跃相一致[25]。Guo等[26] 对青春期前睾丸组织进行 scRNA⁃seq 分析，发现增殖调控基因 Cy⁃ clins、CDKs、TOP2A、MKI67、KIT在精原细胞中表达上调；同时发现激活素受体 ACVR1B、BMPR1B、 ACVR2B表达于精原细胞，而在未分化精原细胞中表达激活素信号的相关抑制剂，这提示Activin信号在精原细胞增殖与分化过程中起到重要作用。利用 GO 注释与 KEGG 分析发现，相关转录因子 SOHLH2、NR6A1 和 CTNNB1 可能参与 SSCs 的增殖与分化过程。比较未分化精原细胞与分化精原细胞亚群转录组水平，发现主要是增殖相关基因的表达，如 MKI67 等基因的上调。以上结果表明，增殖相关基因及转录因子在SSCs增殖与分化过程中起重要作用，这在维持产生足够数量的精子中起到重要作用。当前，已鉴定出的增殖调控关键因子的作用及其机制需进一步验证。
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4 小结与展望
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目前，scRNA⁃seq 技术研究人精原干细胞的技术瓶颈主要在于两点。其一，scRNA⁃seq 技术的目标样本来源于经过酶消化获取的睾丸细胞，这种条件下，酶消化破坏了各细胞在睾丸生精小管中的空间结构，仅能获取单个细胞转录组水平信息，无法判断SSCs在空间位置上的转录组水平变化。另外，在使用两步酶消化方法获取睾丸细胞过程中，可能存在生精小管中的SSCs消化不全的问题，导致获取的细胞不足以代表SSCs的实际组成。空间转录组学可以有效解决当前问题，空间转录组测序技术可以结合显微成像和测序技术在获得基因表达数据的同时最大程度地保留样本的空间位置信息[27]，结合scRNA⁃seq技术鉴定的不同SSCs亚群及转录组水平信息，可以有效描述不同SSCs亚群的空间组成及转录组水平变化。其二，scRNA⁃seq 技术是在转录组水平上描述精原干细胞，仅能比较不同 SSCs亚群的转录组水平变化。然而，精子发生这一复杂过程受到多方面调控，由于技术限制，scRNA⁃seq 技术无法描述不同SSCs亚群在代谢组学、蛋白质水平、转录后调控如 microRNA 等水平上的变化。基于scRNA⁃seq 技术，联合多组学分析能有效描述精原干细胞在精子发生中的生物过程。
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综上所述，scRNA⁃seq 技术可高效捕获睾丸内单个细胞，进行高通量测序分析，获取其转录组水平信息，精细描述细胞类型，揭示细胞异质性，推测其发育轨迹。近年，诸多研究鉴定不同SSCs亚群，揭示其转录谱水平及功能变化，提供用于鉴定、分选SSCs亚群的基因标志物，为SSCs自我更新、增殖与分化研究提供理论基础。然而，scRNA⁃seq 技术是基于已消化的睾丸细胞，从而难以揭示睾丸空间异质性。另外，个体之间存在遗传差异，因而不同研究分析结果存在偏差。未来，对人睾丸 scRNA⁃ seq数据集，进行大样本联合分析具有重要价值，有助于区分样本及细胞类型差异；进一步联合多组学 （空间转录组学、DNA 甲基化组、组蛋白修饰等）分析，更有助于阐释睾丸SSCs空间构成及其转录组水平，在揭示SSCs增殖与分化调控机制并深入研究精子发生生物学过程中具有重要价值，可能为男性不育诊疗提供新策略。
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摘要
精原干细胞的自我更新、增殖与分化对于维持精子发生至关重要。然而，调控这一过程的分子机制尚未完全阐明。精原干细胞具有不同细胞亚型，其在精子发生过程中扮演不同角色。单细胞转录组测序技术提供有效的手段，揭示各精原细胞亚型及其转录组水平和生物学功能变化，为精原干细胞的分子机制研究提供新思路。
Abstract
The self - renewal，proliferation and differentiation of spermatogonial stem cells are critical for maintaining spermatogenesis. However，the molecular mechanism mediating this process remains largely unclear. Spermatogonial stem cells include different cell subtypes which play different roles in spermatogenesis. Single - cell RNA sequencing technology provides an effective method to reveal different subtypes of spermatogonia and their changes in transcriptome levels and biological functions，which could provide new perspectives for investigaing further molecular mechanisms of spermatogonial stem cells.