胃食管反流病（gastroesophageal reflux disease， GERD）是上消化道的慢性疾病，其发病率逐年升高^[1]。反流性食管炎（reflux esophagitis，RE）是胃食管反流病的常见类型之一，盐酸及胆汁酸等反流物质的长期刺激会导致食管远端的炎症反应，并随着反流时程的延长进展至 Barrett 食管甚至食管腺癌^[2]。既往研究发现，暴露于酸性胆盐的食管上皮细胞炎症因子分泌显著增加^[3]。然而，盐酸及胆汁酸诱导食管上皮炎症的确切机制尚未完全阐明，深入探讨介导食管上皮炎症的具体机制能为RE的治疗提供新的理论依据。

线粒体是内源性活性氧（reactive oxygen species， ROS）生成的主要部位，大量ROS诱导的氧化应激会导致线粒体功能障碍。作为线粒体遗传物质存在的线粒体 DNA（mitochondrial DNA，mtDNA）靠近呼吸链且缺乏保护性组蛋白，因此极易受到ROS的攻击，导致 mtDNA 损伤并从线粒体释放到胞质中^[4]。作为线粒体损伤相关分子模式（mitochondrial damage⁃ associated molecular pattern，mtDAMP），mtDNA 可以通过结合模式识别受体（pattern recognition receptor， PRR）激活固有免疫系统^[5-6]。

环鸟苷酸⁃腺苷酸合酶（cyclic GMP⁃AMP synthase， cGAS）作为 PRR 之一是胞质 DNA 感受器，能识别并结合胞质双链DNA，催化ATP和GTP转化为环二核苷酸cGAMP，其作为第二信使结合并激活干扰素基因刺激蛋白（stimulator of interferon gene，STING），随后 STING 招募并激活 TANK 结合激酶 1（TANK binding kinase1，TBK1）和 IκB 激酶（IκB kinase， IKK），这些激酶磷酸化并激活干扰素调节因子 3 （interferon regulatory factor 3，IRF3）和核因子 κB （nuclear factor kappa⁃B，NF⁃κb），促进Ⅰ型干扰素及其他细胞因子的表达。cGAS⁃STING 通路参与炎症性疾病、神经退行性疾病及肿瘤等多种疾病进程^[7-9]。本研究拟探讨酸性DCA诱导食管上皮炎症过程中，mtDNA 损伤及释放与 cGAS⁃STING 通路之间的联系，为酸性胆盐反流引起慢性食管炎症的发病机制提供新的理论依据。

1 材料和方法

1.1 材料

人正常食管上皮细胞系（HEEC）购自美国ATCC。去氧胆酸（deoxycholic acid，DCA，MedChemExpress 公司，美国），CCK⁃8试剂盒（APE×BIO公司，美国）， ROS检测试剂盒、线粒体膜电位（mitochondrial mem⁃ brane potential，MMP）检测试剂盒及 ATP 检测试剂盒（上海碧云天科技公司），线粒体活性氧（mitochon⁃ drial reactive oxygen species，mtROS）Mitosox 荧光探针（Invitrogen公司，美国），细胞基因组DNA提取试剂盒（北京天根生化科技公司），HiScript^®ⅡQ RT SuperMix 和 ChamQ SYBR qPCR Master Mix（南京诺唯赞公司）；cGAS抗体及γH2AX抗体（Cell Signaling Technology 公司，美国），STING 抗体和 TOMM20 抗体（Abcam 公司，美国），p⁃NF⁃κB p65抗体和NF⁃κB p65抗体（上海Abmart公司），抗DNA抗体（Progen抗体，德国），β⁃actin抗体（北京博奥森生物公司）。

1.2 方法

1.2.1 细胞培养和处理

使用含20%胎牛血清的DMEM高糖培养基，在 5% CO₂、37℃的培养箱中培养。当细胞生长至融合度达 80%左右时传代并进行后续实验。酸性 DCA 溶液的配制如下：酸性培养基用 36%~38%的浓盐酸在 DMEM 培养基中滴定至 pH=5，在此酸性培养基中加入一定量的 DCA 贮备液配成含不同浓度 DCA 的酸性培养基，充分混匀后即为酸性 DCA 溶液。对照组即为不含DCA的中性培养基，即DMEM 培养基^[3]。

1.2.2 CCK⁃8实验检测细胞活性

HEEC 接种于 96 孔板，1×10⁵ 个/孔，贴壁生长 24 h，酸性DCA组设置50、100、200、300 μmol/L 4个浓度及2、4、6、8 h 4个时间点，同时设置对照组及空白组，CCK⁃8试剂盒测定细胞存活率，细胞存活率= [（实验孔吸光度-空白孔吸光度）/（对照孔吸光度空白孔吸光度）]×100%。

1.2.3 流式细胞术检测ROS、mtROS和MMP

将处于对数生长期且生长状态良好的细胞接种于6孔板，待细胞贴壁后给药处理，PBS润洗后胰酶消化离心，将探针稀释在特定溶液中孵育一定时间，孵育结束后离心并清洗，上机检测。

1.2.4 荧光显微镜检测ROS、mtROS和MMP

将处于对数生长期且生长状态良好的细胞接种于6孔板，待细胞贴壁后给药处理，PBS润洗后加入荧光探针孵育，孵育结束后吸弃并清洗，荧光显微镜采集图像。

1.2.5 ATP检测

将处于对数生长期且生长状态良好的细胞接种于6孔板，待细胞贴壁后给药处理，使用ATP检测试剂盒进行检测，配制不同浓度梯度的ATP标准溶液，绘制标准曲线，将 ATP 检测工作液加入样品和标准品中，使用光度计检测相对光单位（relative light unit，RLU）值。BCA法检测蛋白浓度，ATP含量 =ATP浓度/蛋白浓度。

1.2.6 细胞免疫荧光

将处于对数生长期且生长状态良好的细胞接种于共聚焦小皿，待细胞贴壁后给药处理，4%多聚甲醛室温固定 20 min，0.1% Triton X⁃100 室温破膜 15 min，5% BSA⁃PBS 室温封闭 2 h，一抗 4℃孵育过夜，隔日二抗避光室温孵育 1 h，DAPI 室温复染 10 min，抗荧光淬灭剂封片，荧光显微镜下采集图像。

1.2.7 实时荧光定量PCR（RT⁃qPCR）

TRIzol 法提取细胞总 RNA，紫外分光光度计测定 RNA 浓度及纯度，按照逆转录试剂说明合成 cDNA，以 cDNA 为模板进行 RT⁃qPCR 扩增。IL⁃1β 上游引物：5′⁃AGCTACGAATCTCCGACCAC⁃3′，下游引物：5′⁃CGTTATCCCATGTGTCGAAGAA⁃3′；IL⁃6上游引物：5′⁃ACTCACCTCTTCAGAACGAATGG⁃3′，下游引物：5′⁃CCATCTTTGGAAGGTTCAGGTTG⁃3′；以 GAPDH 为内参，上游引物：5′ ⁃ ACCATCTTCCAG⁃ GAGCGAG⁃3′，下游引物：5′⁃GATGGCATGGACTGT⁃ GGTCA⁃3′。RT⁃qPCR反应条件：预变性95℃ 30 s； 40 次循环反应 95℃变性 10 s，60℃退火 30 s；95℃ 变性15 s，60℃退火60 s，95℃变性15 s。以GAPDH 作为内参，采用2^-ΔΔCt法计算目的基因mRNA相对表达量。

1.2.8 mtDNA拷贝数测定

将处于对数生长期且生长状态良好的细胞接种于 6 孔板，待细胞贴壁后给药处理，按照细胞基因组 DNA 提取试剂盒说明书进行 DNA 提取，紫外分光光度计测定 DNA 浓度及纯度，以基因组 DNA 为模板进行 RT⁃qPCR 扩增，mtDNA 拷贝数的检测以细胞核 DNA 作为参照，B2M 基因代表细胞核 DNA，ND1 及 ND2 基因代表 mtDNA。ND1 上游引物：5′⁃CTCTTCGTCTGATCCGTCCT⁃3′，下游引物： 5′⁃TGAGGTTGCGGTCTGTTAGT⁃3′；ND2上游引物： 5′⁃GTAGACAGTCCCACCCTCAC⁃3′，下游引物： 5′⁃TTGATCCCGTTTCGTGCAAG⁃3′；B2M上游引物： 5′⁃CCAGCAGCGAATGGAAAGTCAA⁃3′，下游引物： 5′⁃TCTCTCTCCATTCTTCAGTAAGTCAACT⁃3′。

1.2.9 Western blot

RIPA裂解液提取细胞总蛋白，BCA法测定蛋白浓度并确定上样量，SDS⁃PAGE凝胶进行电泳，电泳结束后冰浴转膜，5%脱脂奶粉溶液室温封闭1 h，一抗 4℃孵育过夜，隔日二抗室温孵育 1 h，ECL 化学发光显影。

1.3 统计学方法

所有数据均使用 GraphPad Prism8 软件进行分析，计量资料以均数±标准差（$\stackrel{-}{x}\pm s$）表示，两组间比较采用t检验，多组间比较采用单因素方差分析，事后比较采用Tukey 检验。P <0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 酸性DCA对HEEC细胞形态和存活率的影响

倒置显微镜下观察酸性DCA（100 μmol/L）处理前后HEEC形态变化，对照组中，细胞贴壁生长且状态良好，形态饱满。随着药物作用时间的延长，细胞逐渐皱缩，空泡增多（图1A）。为了探究酸性DCA 对HEEC存活率的影响，将不同浓度酸性DCA溶液处理细胞2、4、6、8 h，CCK⁃8法检测细胞存活率，结果如图1B所示，HEEC的存活率随着浓度的增加及暴露时间的延长而降低，呈浓度⁃时间依赖性。当干预浓度为200 μmol/L及300 μmol/L时，细胞存活率极显著降低。当干预浓度为50 μmol/L及100 μmol/ L时，与对照组相比，细胞存活率下降，且差异具有统计学意义（P <0.001），依据既往研究^[10-11]，本研究中选择100 μmol/L作为后续实验的干预浓度。

2.2 酸性DCA诱导HEEC线粒体功能障碍

用酸性DCA（100 μmol/L）处理HEEC 2 h后，荧光显微镜及流式细胞仪检测细胞内ROS、mtROS和 MMP 水平。如图2A~F 所示，与对照组相比，酸性 DCA 处理后细胞内 ROS 及 mtROS 水平显著升高，MMP 显著降低。用酸性 DCA（100 μmol/L）处理 HEEC 4 h 后，如图2G 所示，与对照组相比，酸性 DCA 刺激后细胞 ATP 水平降低。运用透射电镜观察线粒体超微结构，如图 H 所示，对照组线粒体结构完整，轮廓清晰，线粒体嵴排列有序，基质均匀； 酸性 DCA 处理后线粒体外形肿胀，线粒体嵴排列紊乱，稀疏，线粒体出现空泡化。上述结果表明，酸性 DCA 诱导 HEEC 线粒体形态改变及功能障碍。

2.3 酸性DCA导致HEEC DNA双链断裂及mtDNA 拷贝数减少及释放

用酸性DCA（100 μmol/L）处理HEEC 4 h后，荧光显微镜下观察γH2AX 阳性细胞，结果如图3A 所示，与对照组相比，酸性DCA处理后γH2AX阳性细胞数显著增加。Western blot 结果如图3B 所示， γH2AX蛋白表达水平高于对照组。为了验证酸性 DCA 处理后 mtDNA 是否从线粒体释放到胞质中， RT⁃qPCR检测mtRNA基因ND⁃1、ND⁃2相对细胞核 DNA基因B2M的表达水平，结果显示，酸性DCA处理后mtDNA拷贝数显著降低（图3C）。进一步用荧光显微镜观察了线粒体与 DNA 共定位情况，如图3D 所示，对照组中，mtDNA 位于线粒体内部，酸性 DCA处理后mtDNA从线粒体释放到胞质中。上述结果表明，酸性DCA 诱导HEEC 双链DNA 断裂，导致DNA损伤，mtDNA释放至胞质中。

2.4 酸性DCA激活cGAS⁃STING信号通路

用酸性DCA（100 μmol/L）处理HEEC 4 h后，与对照组相比，酸性 DCA 组 cGAS、STING 及 p⁃NF⁃κB p65蛋白表达增加，RT⁃qPCR结果显示炎症因子IL⁃6 及 IL ⁃1β表达水平增加（图4A、B）。cGAS 抑制剂 RU.521 预处理抑制了酸性 DCA 诱导的 cGAS、 STING及p⁃NF⁃κB p65表达水平的升高，同时炎症因子IL⁃6及IL⁃1β表达水平降低（图4C、D）。

3 讨论

GERD 是全球最常见的慢性疾病之一，具有死亡率低但发病率高的特点，RE是GERD常见的类型之一^[1]。研究表明，酸性胆盐刺激食管上皮细胞分泌IL⁃8及IL⁃1β等细胞因子^[3]，MAPK、PKC及PKA等信号通路介导了这一过程^[10-11]。本研究采用酸性 DCA刺激人正常食管上皮细胞的方法初步模拟RE 的发生发展过程，探讨mtDNA损伤及释放与cGAS⁃ STING通路在食管上皮炎症中的关联。结果表明，酸性DCA诱导线粒体功能障碍，进一步导致mtDNA 双链断裂及释放，激活cGAS⁃STING通路，促进下游炎症因子的分泌。

近年来，线粒体在疾病发生发展中的作用备受关注。内源性ROS主要在线粒体呼吸链上产生，在正常机体内，ROS 的产生和清除受到严格控制，当体内氧化和抗氧化系统处于失衡状态时，ROS的清除受限从而在体内蓄积，导致细胞毒性及组织和机体损伤^[12]。既往研究表明，酸性胆盐诱导Barrett食管上皮细胞线粒体氧化应激，在食管腺癌发展过程中起重要作用^[13]。本研究发现酸性 DCA 诱导 ROS 及 mtROS 产生增多，MMP 降低以及 ATP 生成减少，提示氧化应激的发生并进一步导致线粒体功能障碍。

DNA 损伤与各种疾病的发病机制相关，导致细胞稳态失衡，诱导炎症、细胞凋亡和衰老^[14-15]。 mtDNA以环状双链DNA的形式存在，对机体正常生命活动至关重要。由于mtDNA缺乏保护性组蛋白，靠近 ROS 产生部位且修复能力有限，mtDNA 比核 DNA（nuclear DNA，nDNA）更容易受到 ROS 的攻击^[16]。既往研究发现，酸性胆盐在下咽癌癌变过程中诱导氧化应激和DNA损伤^[17]。本研究发现酸性 DCA诱导细胞氧化应激，γH2AX表达水平升高，提示ROS攻击DNA并造成双链断裂。DNA双链断裂 （DNA double strand break，DSB）是最严重的损伤形式且难以完全修复，当损伤持续发生时，会引起大量异常DNA在细胞内蓄积^[18]。

真核细胞DNA存在于细胞核与线粒体，病理情况下，高水平氧化应激可诱导线粒体功能障碍，增强线粒体通透性转变，导致DNA损伤并从线粒体泄漏到胞质中^[19]。胞质双链 DNA 可作为 DAMP 被 PRR 之一的 cGAS 检测到。既往研究发现，化疗药伊利替康会引起 DNA 损伤和双链 DNA 释放，激活 cGAS⁃STING通路从而导致肠黏膜炎^[20]。本研究探讨了酸性 DCA 刺激后 mtDNA 拷贝数及线粒体与 DNA的共定位，结果表明mtDNA拷贝数减少并从线粒体释放到胞质中，提示mtDNA损伤后从线粒体释放，进而激活了cGAS⁃STING通路。

NF⁃κB 是促炎基因表达的关键调节器之一，诱导促炎细胞因子 IL⁃1β、IL⁃6、IL⁃8 及 TNF⁃α的转录^[21]。既往研究证明，盐酸通过激活NF⁃κB通路刺激人食管上皮细胞系（Het⁃1a）分泌炎症因子^[11]。暴露于过量锰可通过激活cGAS⁃STING/NF⁃κB通路诱导神经炎症^[22]。RU.521 是应用广泛的 cGAS 抑制剂，可强效且选择性抑制人和鼠的 cGAS 酶活性和下游炎症发生^[23]。RU.521能抑制小鼠脑静脉窦血栓模型中被激活的cGAS⁃STING/NF⁃κB通路以及下游炎症因子的分泌，改善神经功能障碍^[24]。本研究发现，酸性DCA通过间接方式激活NF⁃κB通路，即 cGAS⁃STING/NF⁃κB 通路，并促进炎症因子 IL⁃6 及 IL⁃1β的分泌，cGAS 抑制剂 RU.521 处理后 cGAS 及STING的表达水平降低及p⁃NF⁃κB⁃p65表达水平被部分抑制，炎症因子IL⁃6及IL⁃1β分泌减少。上述结果表明NF⁃κB介导的cGAS依赖性炎症反应可能在酸性DCA诱导的食管上皮细胞炎症中起重要作用。

综上所述，本研究发现，酸性 DCA 诱导人正常食管上皮细胞线粒体功能障碍，进一步导致mtDNA 损伤及释放，从而激活 cGAS ⁃ STING 通路，抑制 cGAS的激活可部分抑制酸性DCA诱导的人正常食管上皮细胞炎症，提示针对 cGAS 的靶向干预有望成为临床治疗RE的新靶点。

参考文献