结肠癌是全球肿瘤相关死亡的第三大原因，也是我国最常见的恶性肿瘤之一^[1]。非转移性结肠癌一经诊断，约 80%的患者可以手术切除，但 30%~50%的预后不良患者出现术后复发^[2]。因此，对于高危Ⅱ期或Ⅲ期结肠癌患者，手术切除后需要进行辅助化疗，以降低复发风险^[3]。

奥沙利铂是第三代铂类辅助化疗药物，主要通过抑制DNA复制进而诱导细胞凋亡^[4]。据报道，奥沙利铂可有效改善Ⅲ期结肠癌患者的预后^[5]。然而，临床治疗中结肠癌患者会出现原发性或继发性奥沙利铂耐药，限制了奥沙利铂的治疗效果。因此，探究奥沙利铂耐药相关靶点及机制符合临床治疗的迫切需求。

本研究通过生物信息学方法筛选出结肠癌细胞中奥沙利铂耐药相关基因锌转运体 8（zinc transporter 8，ZIP8）。ZIP8，又称溶质载体家族39成员8（solute carrier family 39 member 8，SLC39A8），是一种转运二价金属离子的膜蛋白，属于锌离子转运蛋白家族，其异常表达与多种人类疾病有关，如高血压、骨关节炎、哮喘和精神分裂症等，但对结肠癌化疗耐药的影响尚不清楚。本研究运用体外实验和临床标本验证ZIP8对结肠癌奥沙利铂耐药的影响，为结肠癌患者的预后和治疗提供理论基础。

1 材料和方法

1.1 材料

人结肠癌细胞 SW620、Annexin V⁃APC 细胞凋亡检测试剂盒（南京凯基生物），siRNA⁃ZIP8（上海吉玛制药），DMEM培养基、胎牛血清、青霉素/硫酸链霉素（Gibco 公司，美国），4×蛋白上样缓冲液（南京诺唯赞），兔抗人 ZIP8 多克隆抗体（Abcam 公司，美国），JetPEI转染试剂（PolyPlus公司，法国）、RIPA试剂、兔抗人GAPDH单克隆抗体、辣根过氧化物酶标记的羊抗兔 IgG、Pierce ECL 曝光液（Invitrogen 公司，美国），TRIzol 试剂、BeyoRTⅡcDNA 合成试剂盒、BeyoFast SYBR Green 试剂盒（上海碧云天生物），CCK⁃8试剂盒（同仁公司，日本），Histostain SP 免疫组化染色试剂盒（上海麦约尔）。

本研究包含2014年1月—2016年12月在巴彦淖尔市医院进行治疗的结肠癌患者。纳入标准：组织学证实的结肠癌；局部晚期或远处转移，纳入研究时判定无法完全切除；无传染性疾病或心脏病； 肾、肝和骨髓功能正常；既往无结肠手术、化疗、放疗史。本研究经过内蒙古医科大学伦理委员会批准（YKD202001250），所有患者及家属均签署知情同意书。

1.2 方法

1.2.1 耐药相关基因筛选

从 NCBI⁃GEO 数据库（https：//www.ncbi.nlm.nih. gov/gds）下载微阵列数据集GSE42387。该数据集包含HCT116、HT29和LoVo及相对应奥沙利铂耐药细胞株的mRNA 微阵列信息。本研究通过GEO2R工具对耐药细胞株和未处理细胞株的数据进行再分析，筛选出4种细胞株共同的耐药基因。采用t检验，以 P <0.05 和|log₂差异倍数（fold change，FC）|>1 为判定标准定义各数据集中有统计学意义的差异基因。

1.2.2 细胞培养与转染

常规复苏人结肠癌细胞株SW620，使用含10% 胎牛血清和1%双抗的 DMEM培养基培养。细胞置于 37℃、5% CO₂的恒温生物培养箱，每 2~3 d更换培养基。待细胞融合度达到 90%，0.25%胰蛋白酶消化细胞并传代。将处于对数生长期的 SW620 细胞按 5×10⁴ 个/孔的密度种植于 6 孔板，待细胞生长至50%密度时，按照JetPEI试剂盒说明书，将siRNA⁃ 阴性对照（negative control，NC）和 siRNA⁃ZIP8 转染至SW620细胞，分别命名为siNC和siZIP8。

1.2.3 实时荧光定量PCR（qRT⁃PCR）

依据TRIzol试剂说明书，分别提取对数生长期的 siNC 组和 siZIP8 组细胞总 RNA，根据 BeyoRTⅡ cDNA合成试剂盒说明书将总RNA逆转录为cDNA。根据 BeyoFast SYBR Green 试剂盒说明书于 ABI 7500 实时荧光定量 PCR 系统上进行样本扩增，反应体系如下：qPCR Mix10 μL、ZIP8/GAPDH 上下游引物（3 μmol/L）各 1 μL、cDNA 模板 2 μL、去离子水 6 μL。引物由南京金斯瑞生物有限公司合成， ZIP8：上游 5′ ⁃ATGCTACCCAAATAACCAGCTC ⁃3′，下游5′⁃ACAGGAATCCATATCCCCAAACT⁃3′；GAP⁃ DH：上游 5′ ⁃CTGGGCTACACTGAGCACC ⁃3′，下游 5′⁃AAGTGGTCGTTGAGGGCAATG⁃3′。每个样品设 3 个复孔，实验重复 3 次。反应结束后，以 GAPDH 为内参照基因，计算各个样本扩增的 CT值，基因表达的相对定量采用2^-ΔΔCT法。

1.2.4 Western blot

待siNC组和siZIP8组细胞进入对数生长期，使用 RIPA 裂解液裂解细胞并提取总蛋白，与蛋白上样缓冲液按比例混合，95℃加热10 min。将等量蛋白注入 ExpressPlus PAGE Gel 预制胶，200 V 电泳30 min。eBlot L1 快速湿转仪将蛋白转移至 PVDF 膜，5%牛血清蛋白常温孵育 2 h，兔抗人 ZIP8 多克隆抗体（1∶1 000）或兔抗人 GAPDH 单克隆抗体（1∶2 000）4℃孵育过夜。次日 PBST 漂洗 3 次，每次 5 min。辣根过氧化物酶标记的羊抗兔 IgG （1∶5 000）常温孵育1 h，PBST漂洗3次，每次5 min。 Pierce ECL 曝光液覆盖 PVDF 膜表面，置于 Tanon 5200S曝光仪曝光并拍照。Image J测定蛋白条带灰度值。以上实验重复3次。

1.2.5 CCK⁃8细胞增殖试验

将siNC组和siZIP8组细胞分别按5×10⁴ 个/孔的密度种植于96孔板，待细胞贴壁后，加入不同浓度的奥沙利铂（终浓度分别为 0、1.25、2.50、5.00、 10.00、20.00 μg/mL），不同浓度设 3 个复孔。48 h 后去除原培养基，每孔加入 10 μL CCK⁃8 溶液和 90 μL DMEM培养基，37℃避光孵育2 h，酶标仪检测各孔在 450 nm 波长处的吸光值。该实验重复3 次。

1.2.6 细胞凋亡检测

将处于对数生长期的SW620细胞按5×10⁴ 个/孔的密度种植于6孔板，待细胞生长至50%密度时加入终浓度为 5 μg/mL 的奥沙利铂，48 h 后消化收集细胞，500 g 离心 5 min，PBS 缓冲液重悬细胞，重复 3 次。去上清，根据 Annexin V⁃APC 细胞凋亡检测试剂盒说明书，加入 500 μL Binding Buffer 重悬细胞，加入 5 μL Annexin V⁃APC 染液混匀，避光室温孵育5 min，BD FACS AriaⅡSORP 分选型流式细胞仪检测。该实验重复3次。

1.2.7 免疫组织化学染色（IHC）分析

所有组织标本均采用 10%中性缓冲福尔马林溶液固定，常规石蜡包埋，4 μm 切片。采用 SP 法对结肠组织样本进行 IHC 染色，详细步骤参见 Histostain SP免疫组化染色试剂盒说明书。

阅片由2位病理科医师双盲独立完成，采用半定量H⁃score方法对Trop2表达进行评分。采用如下染色强度评分：0分表示阴性；1分为弱阳性；2分为中度阳性；3分为强阳性。每个强度级别的细胞总数乘以相应的强度评分，得到强度百分比评分。然后将 4 种强度百分比评分相加，计算最终染色评分。最终染色评分最低为 0 分（无染色），最高为 300 分（所有细胞均为强阳性）。使用X⁃tile 软件程序确定临界值，0~130 分认为 ZIP8 蛋白低表达， 131~300分认为ZIP8蛋白高表达。

1.3 统计学方法

使用SPSS 22.0统计软件对数据进行分析，符合正态分布的计量资料以均值±标准差（$\stackrel{-}{x}\pm s$）表示， SNK⁃q检验比较两组间差异。满足PH假设检验后，通过Cox比例风险回归模型确定预后因素。生存曲线绘制采用 Kaplan⁃Meier 法，生存曲线比较采用时序检验，P <0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 耐药蛋白的筛选

通过比较HCT116、HT29和LoVo耐药细胞株与非耐药株的基因差异，筛选出4个结肠癌细胞耐药后共同的差异基因 ZIP8、NUPR1、SLC43A1 和 TEME73（图1A）。使用 Ualcan 数据库检测 ZIP8、 NUPR1、SLC43A1 和 TEME73 基因在结肠组织中的表达及其与患者预后的关系，发现 ZIP8 在结肠癌组织（n=275）中表达水平显著高于正常肠组织 （n=349）（P <0.05，图1B），且仅ZIP8高表达的结肠癌患者预后较差（P=0.005，图1C），因此将ZIP8作为进一步研究对象。

2.2 干扰SW620细胞的ZIP8表达

将 siRNA⁃ZIP8 转染至结肠癌细胞株 SW620，通过检测ZIP8的表达情况观察siRNA⁃ZIP8的干扰效率，qPCR 结果显示 siZIP8 组细胞的 ZIP8 mRNA 水平较 siNC 组显著下降，差异具有统计学意义 （P <0.05，图2A）。Western blot 结果显示，相较于 siNC组细胞，siZIP8组细胞的ZIP8蛋白表达明显降低（P <0.05，图2B）。以上结果表明，siRNA⁃ZIP8可以下调SW620细胞的ZIP8表达。

2.3 干扰ZIP8表达可增强奥沙利铂对结肠癌细胞的增殖抑制

通过 CCK⁃8 实验检测 siNC 组和 siZIP8 组在奥沙利铂处理后细胞增殖情况的变化。如图3所示，在相同药物浓度下，siZIP8 组细胞增殖抑制率高于 siNC 组（P <0.05，图3）。经计算得出，奥沙利铂对 siZIP8 组的半数抑制浓度（IC₅₀）为（1.926 ± 0.103）μg/mL，低于 siNC 组[（5.156±0.147）μg/mL]，差异有统计学意义（P <0.05）。结果表明，ZIP8 表达被干扰后，奥沙利铂对结肠癌细胞增殖的抑制作用得到增强。

2.4 干扰ZIP8表达可促进奥沙利铂治疗后结肠癌细胞的凋亡

通过流式细胞术检测 siNC 组和 siZIP8 组细胞在奥沙利铂处理后凋亡情况的变化。未加药培养时 siNC 组和 siZIP8 组细胞的总凋亡率分别为 （2.413±0.535）%和（4.213±0.716）%，奥沙利铂处理后 siNC 组和 siZIP8 组细胞的总凋亡率分别为 （10.423±1.616）%和（25.374±2.711）%（图4）。正常情况下 siZIP8 组细胞的总凋亡率略高于 siNC 组 （P <0.05），加药培养后siZIP8组细胞的总凋亡率显著高于siNC组（P <0.05）。结果表明，ZIP8表达下调能促进细胞凋亡，且导致奥沙利铂诱导的凋亡增加。

2.5 结肠癌组织中 ZIP8 表达情况与临床预后的关系

本研究入选了 142 例结肠癌患者，中位年龄 64（23~78）岁，男107例（75.35%），女35例（24.65%）。化疗前患者临床特征见表1，结肠癌组织中ZIP8蛋白的表达情况见图5A。本研究中，中位随访时间为 23.5 个月（3.6~72.4 个月），其中 45.07%的患者死亡。61例患者死于肿瘤进展，3例死于脑梗死。化疗的临床有效率为 75.35%（107 例部分缓解，35 例病情稳定）。

分析化疗后结肠癌患者的生存期发现，ZIP8 低表达的患者有更长的总生存期（OS，log⁃rank χ ² =11.839，P=0.001）和无病生存期（DFS，log⁃rank χ² =13.404，P <0.001，图5B）。在单因素分析中， ZIP8表达、AJCC分期和残留癌是决定OS和DFS的独立因素（表2）。多因素分析发现，ZIP8表达高低是化疗前预测 OS（HR=3.412，95%CI：1.574~7.869， P=0.002）和 DFS（HR=2.676，95% CI：1.362~5.375， P=0.004）的预后指标。

3 讨论

奥沙利铂是第三代铂类抗肿瘤药物，通过与 DNA 双链共价结合形成链间交联，阻止 DNA 复制和转录，导致细胞死亡^[6]。奥沙利铂是结肠癌临床化疗的一线药物，大约 50%的患者可从奥沙利铂联合化疗中受益，但长期大剂量应用奥沙利铂引起的肿瘤耐药是导致化疗效果减弱及丧失的主要原因^[7]。同时，奥沙利铂耐药与结肠癌患者根治术后复发率密切相关^[8]。奥沙利铂耐药是由多种机制引起的，包括化疗耐药相关蛋白的过表达、DNA⁃铂类加成物的形成以及信号转导通路的突变^[9]。

本研究通过 GEO 数据库对比了结肠癌细胞 HCT116、HT29和LoVo与各自对应耐药株的基因表达，分别筛选出213、551和406个差异基因，其中包括 4 个共同差异基因 ZIP8、NUPR1、SLC43A1 和 TEME73。在GEPIA 数据库中比较349例正常结肠组织和275例结肠癌组织的mRNA 信息，发现ZIP8 在结肠癌组织中显著高表达，而NUPR1在结肠癌组织中的表达显著低于正常组织。进一步通过Ualcan 数据库发现ZIP8高表达的患者预后较低表达患者差。以上结果表明，ZIP8是一个具有研究价值的结肠癌奥沙利铂耐药相关基因。

ZIP8是一种调节二价金属离子（Zn²⁺、Fe²⁺、Co²⁺、 Mn²⁺ 和Cd²⁺）内流的多功能膜转运体^[10]。ZIP8的异常表达与多种人类疾病有关，如血压升高、骨关节炎、哮喘和精神分裂症^[11-14]。ZIP8也被认为对脂质多糖、TNF⁃α和 IL⁃1β等炎症刺激具有高度的反应性^[15]。锌可参与肿瘤的调节，而ZIP8在控制锌浓度方面至关重要，因此研究人员对ZIP8在肿瘤发生发展中的作用越来越感兴趣^[16-17]。研究表明，ZIP8能通过NF⁃κB信号通路促进神经母细胞瘤的发展，干扰 ZIP8 表达可降低基质金属蛋白酶的表达水平，进而抑制神经母细胞瘤癌细胞的迁移潜能^[18]。此外，ZIP8 还参与了细胞骨架排列、增殖和迁移的调控^[19]。Geng 等^[20] 发现 ZIP8 通过调节抗凋亡蛋白 Bcl⁃2的水平而非顺铂摄取途径促进大鼠小胶质细胞和小鼠胚胎成纤维细胞的顺铂耐药。作为多种生物功能必需的转运体，ZIP8对肠癌顺铂耐药的影响有待进一步探究。

本文通过转染 siRNA⁃ZIP8 干扰 SW620 细胞中 ZIP8的表达。结果显示，转染 siZIP8组细胞中ZIP8 mRNA 和蛋白表达显著降低，表明siRNA⁃ZIP8成功干扰 SW620 细胞 ZIP8 的表达。CCK⁃8 实验和流式细胞术结果显示，奥沙利铂处理后siNC组细胞增殖率高于 siZIP8 组，奥沙利铂对 siZIP8 组细胞的半数抑制浓度降低，siZIP8 组细胞凋亡率显著高于 siN 组，表明 ZIP8表达下调后奥沙利铂对结肠癌细胞增殖的抑制作用增强，奥沙利铂所致结肠癌细胞的凋亡率增高。以上结果提示干扰 ZIP8表达可以提高结肠癌细胞对奥沙利铂的敏感性，ZIP8能增强结肠癌细胞对奥沙利铂的耐受性。

随后本研究通过IHC检测了142例结肠癌患者癌组织中ZIP8表达，并分析了ZIP8水平和患者预后的关系。结果证明，ZIP8高表达患者的无病生存期和总生存期均短于ZIP8低表达患者。单因素分析表明，AJCC分期、残留癌和ZIP8表达水平与无病生存期和总生存期长短有关。多因素分析进一步证明，ZIP8是结肠癌患者接受化疗后除残留癌之外的又一预后指标，ZIP8高表达的结肠癌患者奥沙利铂治疗效果更差。临床样本信息验证了ZIP8对结肠癌奥沙利铂耐药的促进作用。

综上，本文探究了ZIP8与结肠癌奥沙利铂耐药的关系，证实了ZIP8可增强结肠癌的奥沙利铂耐药性。作为预测结肠癌化疗预后的潜在指标之一，ZIP8 有可能成为治疗结肠癌奥沙利铂耐药的新靶点。

参考文献