糖尿病肾病（diabetic kidney disease，DKD）是糖尿病最常见的微血管并发症之一，是终末期肾病（end stage renal disease，ESRD）发生的主要原因^[1]。DKD的病理特征是肾小球硬化、细胞外基质（extracellular matrix，ECM）合成增加、肾小管萎缩和肾小管间质纤维化^[2]。越来越多的研究表明肾小管上皮细胞的上皮细胞⁃间充质转化（epithelial⁃mesenchymal tran⁃ sition，EMT）及纤维化在 DKD 的进展中起重要作用，然而目前 DKD 的治疗仍以控制血糖、血压、调节血脂为主要治疗原则，在抗纤维化方面效果并不明显^[3]。

达格列净是一种钠⁃葡萄糖协同转运蛋白2（so⁃ dium⁃glucose transporter 2，SGLT⁃2）抑制剂，可以抑制葡萄糖的重吸收，促进尿糖排出，降低血糖。近年来研究发现，达格列净还具有肾脏保护作用^[4]，然而其具体机制尚未明确。转化生长因子⁃β1（trans⁃ forming growth factor β1，TGF⁃β1）是作用最强的致纤维化细胞因子，通过介导多种信号参与肾纤维化的发生发展^[5]。信号转导与转录激活因子 1（signal transducer and activator of transcription 1，STAT1）是 STAT转录因子家族成员，与高糖诱导的氧化应激、 TGF⁃β1的表达以及ECM蛋白Ⅳ型胶原蛋白和纤连蛋白（Fibronectin）的产生有关^[6]。泛素蛋白酶体系统是细胞内蛋白质降解的主要途径，可以严格调控 TGF⁃β超家族信号转导。Rffl是一种能抑制内体再循环的 E3 泛素连接酶，可通过调控 PRR5L 降解促进mTORC2介导的PKC⁃δ磷酸化从而延缓肺纤维化进展^[7]。然而 Rffl 在肾纤维化中的作用还未见报道。设想达格列净的肾保护机制可能与上调Rffl的表达抑制STAT1/TGF⁃β1通路相关。

本研究通过高糖培养肾小管上皮细胞模拟糖尿病肾病环境，探讨达格列净是否通过上调 Rffl的表达抑制STAT1/TGF⁃β1信号通路从而改善DKD肾小管上皮细胞的EMT和纤维化，为DKD的治疗提供理论基础。

1 材料和方法

1.1 材料

人肾小管上皮细胞 HK⁃2 细胞（上海中乔新舟公司）；胎牛血清、DMEM 高糖培养基（含有 4.5 g/L D⁃葡萄糖）、DMEM 低糖培养基（含有 1 g/L D⁃葡萄糖）、0.25%胰蛋白酶、链霉素、青霉素（Gibco 公司，美国）；达格列净（Med Chem Express公司，美国）；鼠抗上皮细胞钙黏蛋白（epithelial cadherin，E ⁃ cad⁃ herin）、纤连蛋白（Fibronectin）、STAT1、α⁃Tubulin单克隆抗体，兔抗α⁃平滑肌肌动蛋白（α⁃smooth muscle actin，α⁃SMA）、TGF⁃β1、Rffl多克隆抗体、山羊抗兔二抗、山羊抗鼠二抗（Proteintech公司，美国）；Trizol、质粒转染试剂Lipofectamine^TM2000脂质体（Invitrogen公司，美国），RT⁃PCR试剂（南京诺唯赞公司），RT⁃PCR 引物（南京金斯瑞公司）；大肠杆菌DH5α（北京擎科生物科技有限公司）；空载质粒PCDH和重组PCDH⁃ Rffl 质粒（广州易锦生物技术有限公司）；PCR 仪 （Eppendorf公司，德国）。

1.2 方法

1.2.1 细胞培养

人肾小管上皮细胞HK⁃2在37℃、5% CO₂的培养箱中用含有10%胎牛血清、1%青霉素（100 U/mL）和链霉素（100 μg/mL）的DMEM培养基培养。细胞生长融合至80%时，用0.25%的胰酶消化细胞，细胞收缩变圆后加入完全培养基终止消化，传代。传代后的细胞在 37℃、5%CO2的培养箱中培养 24 h 后换液 1 次，以去除死亡的细胞，以后每 2 d 换液 1 次。取对数生长期的细胞用于实验研究。

1.2.2 分组

收集对数期 HK⁃2 细胞，使用含 4.5 g/L 葡萄糖的DMEM高糖培养基培养48 h，记作高糖组（HG组）； 使用含有 1 g/L 葡萄糖的 DMEM 低糖培养基培养 48 h，记作对照组（NC 组）。收集对数期 HK⁃2 细胞接种于6孔板，分为低剂量达格列净+高糖组（Dap⁃L组，使用含有5 μmol/L达格列净的DMEM高糖培养基培养48 h），高剂量达格列净+高糖组（Dap⁃H组，使用含有10 μmol/L达格列净的DMEM高糖培养基培养 48 h），PCDH 组（PCDH 转至 HK ⁃2 细胞，使用 DMEM高糖培养基培养48 h），PCDH⁃Rffl组（PCDH⁃ Rffl转至HK⁃2细胞，DMEM高糖培养基培养48 h）。

1.2.3 Western blot检测

取按照上述分组培养48 h的各组细胞，加入适量的 RIPA 细胞裂解液提取细胞中的蛋白，BCA 试剂盒对蛋白进行定量，蛋白样品与上样缓冲液按照 1∶5的比例充分混匀，100℃煮沸变性10 min，每个样品取50 μg进行聚丙烯酰胺凝胶电泳（SDS⁃PAGE）分离，90 V 低温电转移 2 h，5%的脱脂奶粉 37℃封闭 1 h，分别加入 E⁃cadherin、α⁃SMA、Fibronectin、Rffl、 TGF⁃β1、α⁃Tubulin抗体，所有抗体均按照说明书稀释，4℃过夜，TBST 洗涤，分别加入 1∶5 000 稀释的 HRP标记的羊抗鼠IgG、羊抗兔IgG，室温孵育1 h，暗室内曝光显影，应用Image J软件分析各条带灰度值。

1.2.4 RT⁃PCR检测

采用TRIzol法提取细胞中总RNA，参照反转录试剂盒合成 cDNA。以 cDNA 为模板进行 qRT⁃PCR 反应，PCR循环条件：95℃ 30 s 预变性；95℃ 10 s， 60℃ 30 s 共 40 个循环；95℃ 15 s，60℃ 60 s，95℃ 15 s 采集熔解曲线。以β肌动蛋白（β⁃actin）为内参，采用2^-∆∆Ct法计算Rffl mRNA的相对表达量。

1.3 统计学方法

所有实验数据采用SPSS 21.0软件进行分析，符合正态分布的计量资料用均数±标准差（$\stackrel{-}{x}\pm s$）表示，两组比较采用 t 检验，多组间差异比较采用单因素方差分析，两两比较采用LSD⁃t检验，P <0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 Rffl在高糖培养的HK⁃2细胞中低表达

qRT⁃PCR检测了低糖和高糖培养的HK⁃2细胞 Rffl的表达水平，结果显示HG组细胞中Rffl mRNA 水平较NC组明显降低。Western blot检测结果证明 HG组细胞中Rffl蛋白表达较NC组明显下调，差异有统计学意义（P <0.05，图1）。

2.2 在高糖培养的HK⁃2细胞中过表达Rffl

qRT⁃PCR 结果显示，转染重组质粒 PCDH⁃Rffl 后，HK⁃2中Rffl的表达水平与PCDH组相比明显上升。Western blot 结果与 qPCR 结果一致，表明成功构建过表达Rffl的HK⁃2细胞（P <0.05，图2）。

2.3 过表达Rffl抑制高糖环境中HK⁃2细胞的EMT 和纤维化

与 NC 组相比，HG 组细胞中 E⁃cadherin 蛋白表达水平降低，Fibronectin、α⁃SMA蛋白表达水平升高 （P <0.05，n=3）；与PCDH组相比，PCDH⁃Rffl组细胞中 E ⁃ cadherin 蛋白表达水平升高，Fibronectin、α⁃ SMA 蛋白表达水平降低（P <0.05，n=3，图3），提示过表达Rffl抑制高糖环境中HK⁃2的EMT和纤维化。

2.4 达格列净抑制高糖处理的 HK⁃2 细胞的 EMT 和纤维化

与 NC 组相比，HG 组细胞中 E⁃cadherin 蛋白表达水平降低，Fibronectin、α⁃SMA蛋白表达水平升高 （P <0.05，n=3）；与HG组相比，Dap⁃L组及Dap⁃H组细胞中 E⁃cadherin 表达水平均升高，Fibronectin、α⁃ SMA表达均降低（P <0.05，n=3）；与Dap⁃L组相比，Dap⁃H组细胞中E⁃cadherin表达水平升高，Fibronec⁃ tin、α⁃SMA表达均降低（P <0.05，n=3，图4），提示达格列净抑制高糖处理的HK⁃2的EMT和纤维化，且达格列净的浓度越高，抑制作用越强。

2.5 达格列净促进高糖培养的HK⁃2细胞中Rffl的表达

与NC组相比，HG组细胞中Rffl蛋白表达水平降低 （P <0.05，n=3）；Dap⁃L组及Dap⁃H组细胞中Rffl表达均高于HG组（P <0.05，n=3）；与Dap⁃L组相比，Dap⁃H 组细胞中Rffl表达水平升高（P <0.05，n=3，图5），提示达格列净促进高糖培养的HK⁃2中Rffl的表达，且达格列净的浓度越高，促Rffl表达的作用越明显。

2.6 过表达 Rffl 抑制高糖培养的 HK ⁃ 2 细胞中 STAT1、TGF⁃β1的表达

相对于 NC 组，HG 组细胞中 STAT1、TGF⁃β1 的表达水平升高（P <0.05，n=3）；与 PCDH 组相比， PCDH⁃Rffl 组细胞中 STAT1、TGF⁃β1 蛋白表达水平均降低（P <0.05，n=3，图6），提示过表达Rffl抑制高糖培养的HK⁃2中STAT1、TGF⁃β1的表达。

2.7 达格列净抑制高糖培养的 HK ⁃ 2 细胞中 STAT1、TGF⁃β1的表达

与 NC 组相比，HG 组细胞中 STAT1、TGF⁃β1 的表达水平升高（P <0.05，n=3）；相比HG组，Dap⁃L组及Dap⁃H组细胞中STAT1、TGF⁃β1表达均降低（P <0.05，n=3）；与 Dap ⁃ L 组相比，Dap ⁃ H 组细胞中 STAT1、TGF⁃β1表达均降低（P <0.05，n=3，图7），提示达格列净抑制高糖培养的HK⁃2中STAT1、TGF⁃β1 的表达，达格列净的浓度越高，抑制作用越显著。

3 讨论

糖尿病是世界范围内日益严重的公共卫生疾病，在全球普通人群中的患病率约为10%。根据国际糖尿病联合会的数据，到2035年，全球糖尿病患者的数量将从2013年的3.82亿增加到5.92亿，其中大约 40%的糖尿病患者会发展为 DKD^[8]。DKD 是糖尿病最严重的微血管并发症之一，是导致 ESRD的主要因素，显著增加了糖尿病患者的病死率。肾小管上皮细胞 EMT 及肾纤维化是 DKD 进展到ESRD 的主要病理基础和共同途径，然而目前针对 DKD的治疗方式在抑制EMT、抗纤维化方面效果有限。如何有效抑制肾小管上皮细胞EMT 及肾纤维化，从而阻止和延缓DKD向终末期肾病发展，是目前亟待解决的难题。

肾小管上皮细胞 EMT 在肾脏纤维化中发挥重要作用^[9-10]，而抑制EMT可以在一定程度上延缓肾纤维化进展。在EMT过程中，上皮细胞的迁移、侵袭、抗凋亡能力增强，促进细胞外基质沉积，加剧肾间质细胞纤维化，严重危害肾脏功能^[11]。E⁃cadherin 作为细胞黏附连接的中心成分，是维持上皮细胞完整性所必需的。α⁃SMA是肌纤维成熟细胞表达的一个特征蛋白，在肾组织中可直接反映纤维化程度^[12]。 Fibronectin是肾纤维化中一种主要的ECM成分，其合成增加会促进ECM积聚，加快肾间质纤维化的进展^[13]。肾EMT常以E⁃cadherin表达量降低，α⁃SMA、 Fibronectin 等间质标志物表达量升高等为主要特征^[14-16]。泛素化修饰是一种重要的蛋白质翻译后修饰，它是泛素分子在一系列酶的作用下，与靶蛋白质共价结合的修饰过程。E3 泛素连接酶MARCH7 能够调控E⁃cadherin和β⁃catenin的表达。在卵巢癌中，USP7通过逆转MARCH7自身的泛素化，并稳定 MARCH7，从而介导 E⁃cadherin 和β ⁃catenin 的表达^[17]。TGF⁃β可以诱导EMT发生，在乳腺上皮细胞中，野生型p53可以调控TGF⁃β信号产生的EMT^[18]，而 E3 泛素连接酶 Rffl 可通过使 MDM2 变得稳定来促进p53的降解^[19]。Rffl还可通过PRR5L降解促进 mTORC2介导的PKC⁃δ磷酸化从而影响肺纤维化进展^[7]。本研究结果显示，高糖处理后肾小管上皮细胞中 E⁃cadherin 表达水平降低，Fibronectin、α⁃SMA 表达水平升高，而Rffl过表达可逆转高糖诱导的肾小管上皮细胞EMT，提示Rffl高表达具有一定的抑制高糖处理的肾小管上皮细胞HK⁃2发生纤维化的作用。

SGLT⁃2抑制剂是一种不依赖胰岛素水平的新型降糖药，除降糖作用外，它还具备降低血压、改善肾小球高滤过、减少蛋白尿、改善氧化应激、抑制炎症等肾脏保护作用^[20-21]。对18周的单侧肾切除db/db小鼠进行 4 周达格列净治疗，肾脏 TGF⁃β1、纤溶酶原激活物抑制物1、Ⅳ型胶原以及Fibronectin的表达均显著降低^[22]。研究表明，达格列净可以通过抑制高糖毒性，进而降低O⁃GlcNAc糖基化修饰和减少肾小管缺氧^[23] 或抑制STAT1/TGF⁃β1通路激活^[24]，从而改善肾小管间质纤维化。本研究结果显示，与高糖组相比，低剂量达格列净+高糖组及高剂量达格列净+ 高糖组中 E⁃cadherin 表达水平均升高，Fibronectin、 α⁃SMA表达水平均降低，并呈现出一定的剂量依赖性，提示达格列净具有抑制高糖处理的肾小管上皮细胞HK⁃2发生纤维化的作用。

TGF⁃β1在EMT和组织纤维化中起重要调节作用，可以正向调控 EMT，是肾间质纤维化及肾小球硬化的重要细胞因子^[25]。高血糖会诱导激活 DKD 中STAT1和TGF⁃β1，并参与肾小管间质纤维化的过程^[24]。抑制STAT1可以抑制肝纤维化的进展^[26]，此外，STAT信号通路在肾纤维化中起着至关重要的作用，激活 STAT 可诱导 EMT 并导致肾损害缓解^[27]。本研究表明，高糖处理后肾小管上皮细胞中STAT1、 TGF⁃β1的表达水平升高，过表达Rffl后STAT1、TGF ⁃β1表达水平降低，这表明在肾小管上皮细胞HK⁃2 中E3泛素连接酶Rffl对STAT1/TGF⁃β1通路具有一定的抑制作用。此外，本研究发现达格列净同样可逆转STAT1、TGF⁃β1的表达水平，并呈现出一定的剂量依赖性，这表明达格列净改善EMT的作用可能与抑制高血糖诱导的STAT1/TGF⁃β1通路相关。

本研究发现，达格列净可缓解高血糖条件下肾小管上皮细胞EMT和纤维化，并抑制了促纤维化因子STAT1和TGF⁃β1的表达。本研究初步探索达格列净对DKD肾小管上皮细胞EMT和纤维化的改善作用及其可能机制，但详细作用机制有待进一步深入探究。

参考文献