溃疡性结肠炎（ulcerative colitis，UC）是一种以结肠黏膜损伤及肠道稳态破坏为特征的慢性、非特异性炎症性疾病^[1]。我国UC发病率呈逐年上升趋势^[2]。UC的发病机制与环境因素、遗传易感性、免疫功能紊乱和肠道菌群失衡相关，免疫因素在 UC 发病中发挥了重要作用^[3-4]。在UC患者和动物模型的结肠组织中存在大量巨噬细胞浸润^[5-6]。

巨噬细胞是固有免疫反应的一线应答者^[7]。巨噬细胞超极化引起的炎症反应在UC中具有重要作用。在不同环境刺激下、巨噬细胞表型及功能处于 M1型（促炎或经典活化型）及M2型（抗炎或替代活化型）的动态转化中^[8]。UC 患者肠黏膜中促炎的 M1 型巨噬细胞数量增加^[9]，M1 型巨噬细胞产生白介素（interleukin，IL）⁃12、IL⁃23和IL⁃1β、促进Th1和 Th17免疫应答，加重肠道上皮损伤^[10]。羟氯喹（hy⁃ droxychloroquine，HCQ）作为经典的抗疟药，具有免疫调节作用，常用于系统性红斑狼疮^[11]、类风湿关节炎^[12] 及抗磷脂抗体综合征^[13] 等疾病的治疗。本研究运用体外诱导的骨髓来源巨噬细胞（bone mar⁃ row ⁃ derived macrophage，BMDM）及葡聚糖硫酸钠 （dextran sulfate sodium salt，DSS）诱导的小鼠急性结肠炎模型，探讨 HCQ 在肠道炎症中的作用及调控 M1/M2型巨噬细胞分化的可能机制。

1 材料和方法

1.1 材料

8 周龄、体重18~22 g的C575L/6雄性小鼠（维通利华实验动物技术有限公司），在南京医科大学实验动物中心、SPF级环境饲养。动物实验严格遵循实验动物饲养及操作规范，符合3R原则，且通过南京医科大学实验动物福利伦理审查委员会审核（IACUC⁃ 1912008）。

Percp/cy5.5⁃CD11b、FITC⁃CD45抗体、APC⁃F4/80 以及PE⁃CD86等流式抗体（BioLegend公司，美国）； p⁃STAT1、STAT1、IRF5、NF⁃κB、p⁃NF⁃κB、NOD 样受体热蛋白结构域相关蛋白 3（NOD⁃like receptor thermal protein domain associated protein 3，NLRP3）、 ASC、pro⁃Caspase⁃1、Caspase⁃1以及β⁃Actin蛋白免疫印记实验一抗（Cell Signaling Technology公司，美国）；ECL显影液（Thermo Fisher公司，美国），HCQ（Sigma 公司，美国），NF⁃κB通路抑制剂吡咯烷二硫代甲酸铵 （pyrrolidinedithiocarbamate，PDTC）（杭州碧云天公司），DSS（MP公司，美国），胶原酶Ⅳ（Biosharp公司，美国），DNA酶Ⅰ（Sigma公司，美国），Percoll溶液（GE 公司，美国）。

1.2 方法

1.2.1 动物分组及DSS结肠炎模型的建立

将小鼠随机分为3组。对照组（n=6）：饮用正常水，每天给予 200 μL 纯水灌胃；DSS 组（n=6）：自由饮用3.5% DSS溶液，并每天给予200 μL纯水灌胃； DSS+HCQ组（n=6）：自由饮用3.5% DSS溶液，并每天给予200 μL HCQ溶液（60 mg/kg）灌胃。构建DSS诱导的小鼠结肠炎模型：配制DSS浓度为3.5%的液体，小鼠自由饮用DSS溶液7 d后，换成正常水饮用2 d。

1.2.2 疾病活动指数（disease activity index，DAI） 评分

每日称量小鼠体重、观察大便性状、检测大便隐血、观察肛周出血等，根据表1计算小鼠DAI评分^[14]。

1.2.3 结肠组织病理学评分

小鼠结肠组织行固定、包埋、切片及 HE 染色后，将切片置于光学显微镜下观察，具体评分标准参考相关文献^[15]（表2）。

1.2.4 实时荧光定量PCR（RT⁃PCR）

利用TRIzol将结肠组织或细胞裂解，氯仿、异丙醇等溶剂提取RNA并检测浓度，根据逆转录试剂盒操作说明逆转录合成cDNA。北京擎科生物科技有限公司进行引物合成。相关引物序列如下：GAPDH （mouse）上游：5′ ⁃AGGTCGGTGTGAACGGA ⁃TTTG ⁃ 3′，下游：5′⁃TGTAGACCATGTAGTTGAGGTCA⁃3′； IL⁃1β（mouse）上游：5′ ⁃AAGGGGACATTAGGCAG⁃ CAC ⁃3′，下游：5′ ⁃ATGAAAGA ⁃CCTCAGTGCGGG ⁃ 3′；IL ⁃ 23（mouse）上游：5′ ⁃ CAGCAGCTCTCTCG⁃ GAATCTC ⁃ 3′，下游：5′ ⁃ TGGATACGGGGCACAT⁃ TATTTTT⁃3′；IL⁃12（mouse）上游：5′⁃CAATCACGC⁃ TACCTCCTCTTTT ⁃ 3′，下游：5′ ⁃ CAGCAGTGCAG⁃ GAATAATGTTTC⁃3′；iNOS（mouse）上游：5′⁃GTTCT⁃ CAGCCCAACAATACAAGA ⁃3′，下游：5′ ⁃GTGGAC⁃ GGGTCGATGTCAC⁃3′；TNF⁃α（mouse）上游：5′⁃AC⁃ GGCATGGATCTCAAAGAC ⁃ 3′，下游：5′ ⁃GTGGGT⁃ GAGGAGCACGTAGT⁃3′；IL⁃6（mouse）上游：5′⁃TC⁃ TATACCACTTCACAAGTCGGA⁃3′，下游：5′⁃GAATT⁃ GCCATTGCACAACTCTTT⁃3′。

1.2.5 小鼠结肠固有肌层单个核细胞的提取

将结肠切成0.5 cm片段，加入EDTA（2% FBS + 0.5 mmol/L EDTA +10 mmol/L HEPES），37℃震荡 40 min去除上皮细胞。筛网过滤，加入胶原酶溶液 （2%FBS+胶原酶Ⅳ+DNA酶Ⅰ），37℃、220 r/min震荡 15 min 充分消化。筛网过滤，收集上清，离心后加入 4 mL 40% Percoll 溶液重悬，缓慢加入 2 mL 75% Percoll 溶液，2 000 r/min、20℃离心 20 min，吸取中间层细胞加入RPMI⁃1640溶液重悬。行流式细胞术检测或用于其他实验。

1.2.6 流式细胞术检测M1型巨噬细胞比例

调整流式管中细胞数为 5×10⁵~1×10⁶ 个，加入 100 μL抗体混合液（FITC⁃CD45、Percp/cy5.5⁃CD11b、 APC⁃F4/80、PE⁃CD86），轻弹混匀，4℃ 避光孵育 30 min。加入 3 mL PBS，300 r/min 离心 5 min，重复 1 次。然后加入 300 μL 流式染色缓冲液重悬细胞，上机检测，用FlowJo_V10软件分析。

1.2.7 BMDM体外诱导分化及培养

分离小鼠胫骨和股骨，暴露骨髓腔，吸取RPMI⁃ 1640 培养基冲洗骨髓至离心管中。无菌滤网过滤，离心后弃上清，加入3 mL红细胞裂解液，静置5 min， PBS 清洗 1 次。用 RPMI⁃1640（含 10%FBS）重悬铺板，加入10 ng/mL M⁃CSF，培养箱中培养，分别于铺板第 3、5、7 天更换培养基，第 7 天获得成熟的骨髓来源巨噬细胞。

1.2.8 BMDM的处理及分组

将BMDM分为对照组、LPS/IFN⁃γ组、HCQ+LPS /IFN⁃γ组和PDTC+LPS/INF⁃γ组。LPS/IFN⁃γ组加入 LPS（100 ng/mL）及 IFN ⁃ γ（20 ng/mL）处理 24 h， HCQ+LPS /IFN⁃γ组提前加入 HCQ（10 μmol/L）预处理 2 h，PDTC+LPS/INF ⁃ γ 组提前加入 PDTC （10 μmol/L）预处理 30 min，之后处理同 LPS/IFN ⁃γ 组，收集细胞进行相关实验。

1.2.9 蛋白质免疫印记实验

蛋白上样后100 V恒压电泳。冰浴状态下250 mA 恒流转 PVDF 膜，5%脱脂牛奶封闭 1 h，加入一抗 （1∶1 000）4℃过夜孵育。次日，TBST 漂洗 3 次，每次10 min；室温下孵育二抗（1∶10 000）1 h；TBST漂洗3次，每次10 min；天能凝胶成像系统曝光显影。

1.3 统计学方法

实验数据使用GraphPad Prism 8软件进行统计学分析及作图，计量数据用均数±标准差（$\stackrel{-}{x}\pm s$）表示，两样本均数比较采用独立样本t检验，多组样本均数比较采用单因素方差分析（one⁃way ANOVA）。 P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 HCQ可减轻DSS小鼠肠道炎症

与DSS组相比，HCQ干预的DSS模型小鼠体重下降延缓（图1B）、DAI评分明显降低（图1C）。结肠大体外观：HCQ干预的DSS模型小鼠结肠黏膜充血水肿程度减轻，一定程度上恢复了结肠长度（图1D、E）。此外，HCQ干预的小鼠结肠组织病理学评分改善，结肠上皮及隐窝、腺体结构的破坏减轻，炎性细胞的浸润明显减少（图1F、G）。

2.2 HCQ抑制模型鼠结肠中M1型巨噬细胞极化

提取各组小鼠结肠固有肌层单个核细胞（lamina propria mononuclear cell，LPMC），流式细胞术检测小鼠结肠LPMC中M1型巨噬细胞的比例。结果显示，与对照组相比，DSS组小鼠肠道M1型巨噬细胞比例明显升高，HCQ干预后M1型巨噬细胞降低（图2A）。 PCR检测M1型巨噬细胞相关炎性因子：与对照组相比，DSS 组小鼠LPMC 中IL⁃1β、IL⁃6、IL⁃12、TNF⁃α、 IL⁃23及iNOS的表达均明显升高，HCQ干预可抑制 IL⁃1β、TNF⁃α、IL⁃23 及 iNOS 的表达，但对 IL⁃6 及 IL⁃12的抑制作用不显著（图2B）。以上结果提示， HCQ 减轻 DSS 模型鼠肠道炎症的作用可能与抑制肠道固有肌层M1型巨噬细胞极化有关。

2.3 HCQ抑制骨髓源性M1型巨噬细胞极化及其相关炎性因子表达

为了证实HCQ 对M1型巨噬细胞极化的作用，提取并诱导分化小鼠 BMDM。①流式细胞术鉴定巨噬细胞纯度，结果显示 F4/80 及 CD11b 双阳性细胞占90%以上，证明巨噬细胞诱导成功（图3A）。② 在M1型巨噬细胞诱导条件下，巨噬细胞形态改变，呈圆形、扁平、煎蛋样形状，与既往研究一致（图3B）。③将细胞分为对照组、LPS/IFN⁃γ组、HCQ+LPS/ IFN⁃γ组，流式检测各组细胞中M1型巨噬细胞比例，结果显示，与未处理对照组相比，LPS/IFN⁃γ刺激24 h 后M1型巨噬细胞比例显著增加，予以HCQ处理后， M1型巨噬细胞比例明显降低（图3C）。④PCR检测各组中 M1 型巨噬细胞相关炎性因子（IL⁃1β、IL⁃6、 IL⁃12、IL⁃23、TNF⁃α）的表达水平。结果显示，LPS/ IFN⁃γ刺激后IL⁃1β、IL⁃6、IL⁃12、IL⁃23、TNF⁃α的表达明显上调，而HCQ则不同程度地抑制了上述炎性因子的表达（图3D）。

2.4 HCQ 通过 NF⁃κB/NLRP3 信号通路抑制 M1 型巨噬细胞极化

首先检测参与调控M1型巨噬细胞极化通路的 p⁃NF⁃κB、p⁃STAT1以及IRF5蛋白表达水平，发现在 LPS/IFN⁃γ处理组中NF⁃κB的蛋白磷酸化水平明显升高，而 HCQ 处理后可显著抑制 NF⁃κB 蛋白磷酸化，但HCQ对p⁃STAT1以及IRF5蛋白表达水平无明显影响（图4A、B）。其次，检测各组中NF⁃κB下游通路炎性小体相关基因的表达，结果提示HCQ可显著抑制 LPS/IFN⁃γ对 NLRP3、Caspase⁃1 以及 ASC 蛋白的上调（图4C~F）。最后，利用NF⁃κB抑制剂PDTC 作为对照，结果发现，PDTC可显著抑制p⁃NF⁃κB及其下游相关基因NLRP3、Caspase⁃1以及ASC蛋白表达水平（图4G~L），并且 PDTC 可显著抑制 M1 型巨噬细胞极化（图4M），与 HCQ对M1型巨噬细胞极化的抑制作用相同。

3 讨论

本研究在DSS诱导小鼠结肠炎模型上，明确了 HCQ 可减轻肠道炎症，并发现可以降低小鼠结肠 M1 型巨噬细胞比例。细胞实验中诱导分化小鼠 BMDM，发现HCQ通过NF⁃κB/NLRP3信号通路抑制 M1型巨噬细胞极化及其炎性因子的释放。

UC是一种慢性非特异性消化道炎症性疾病，研究发现M1型巨噬细胞极化与肠道炎症有关^[16]。本研究也证实，DSS结肠炎模型鼠肠道固有肌层中M1型巨噬细胞比例增加，同时 M1 型巨噬细胞相关细胞因子，如 IL⁃1β、IL⁃6、IL⁃12、IL⁃23、TNF⁃α等释放增加，提示结肠炎的形成与 M1 型巨噬细胞增加及其促炎因子释放增加有关。

HCQ 为氯喹的衍生物，临床上用于多种免疫性疾病的治疗^[17]。研究发现HCQ可通过减少小鼠肾脏中白细胞及巨噬细胞浸润减轻缺血/再灌注导致的肾脏炎症反应，并改善肾纤维化^[18]。本研究给予DSS诱导的结肠炎模型鼠HCQ干预，发现HCQ灌胃可明显缓解DSS结肠炎鼠的体重减轻、血便、大便不成形等症状，且对炎症导致的结肠缩短及肠黏膜水肿充血也有改善作用。组织病理学提示HCQ减少固有层及黏膜下层炎性细胞浸润、改善腺体结构及减少隐窝的破坏。

进一步提取了对照组、DSS组及DSS+HCQ组小鼠的结肠 LPMC，发现 DSS+HCQ 组 M1 型巨噬细胞较 DSS 组降低，提示 HCQ 抑制了 M1 型巨噬细胞的极化。同时PCR检测了M1型巨噬细胞相关炎性因子，与流式结果一致，DSS造模后M1型巨噬细胞的炎性因子表达上调，而HCQ干预后，显著下调了如 IL⁃1β、TNF⁃α、IL⁃23及iNOS的表达，以上研究提示 HCQ抑制巨噬细胞向M1极化，减少炎性因子释放，进而减轻DSS诱导的肠道炎症。

为探究HCQ 抑制M1型巨噬细胞极化的机制，体外诱导分化小鼠BMDM，发现HCQ可抑制NF⁃κB 信号通路，而对 IRF5 和 STAT1 通路无明显影响。 NLRP3炎性小体是一种多蛋白复合物，被认为是炎症反应的关键^[19]，同时，NF⁃κB是NLRP3炎性小体激活的重要诱导剂^[20]。因此对NF⁃κB下游的NLRP3炎性小体相关基因进行验证，发现 HCQ 显著抑制了 NLRP3炎性小体复合物中相关基因的表达。最后，利用NF⁃κB通路抑制剂PDTC作为对照，得到相似的结果。以上结果提示，HCQ可能抑制NF⁃κB/NLRP3信号通路、抑制M1型巨噬细胞极化，减少其炎症因子释放。

总之，本研究证实了HCQ可以减轻DSS模型鼠肠道炎症，可能机制是抑制NF⁃κB/NLRP3信号通路进而抑制M1型巨噬细胞极化，为UC的治疗提供了新方法。本研究尚有一定的局限性，如未在动物体内验证HCQ抑制M1型巨噬细胞极化的相关通路，后续将进一步研究补充完善。

参考文献