癌症是当前全球广泛关注的健康问题，具有慢性发展和致死倾向两大特征。近年来，癌症的发病率和致死率迅速上升，已成为中国最常见的疾病死因，在美国是仅次于心脏病的第二大疾病死因^[1]。与癌症发病相关的主要风险因素包括遗传、吸烟、饮酒、肥胖、不健康的饮食习惯和运动量不足等^[2]。根据 2020 年全球癌症统计数据，乳腺癌已超过肺癌，成为世界上最常见的癌症^[3-4]，同时是女性癌症相关死亡的主要原因^[4-6]。但目前对癌症的治疗，如手术切除、放疗、化疗和靶向治疗，通常需要较长的周期，不良反应较大，复发率较高^[7]。因此，有必要探究影响癌症进展的潜在分子机制，并以此提供新的诊疗方法。

生长抑制特异性基因6（growth arrest specific 6， Gas6）编码一种可与受体酪氨酸激酶Axl、Mer和Tyro3 结合的维生素 K 依赖性分泌型蛋白。细胞因子 Gas6 通过与 TAM（Tyro3⁃Axl⁃Mer）受体结合激活下游信号通路（如PI3K、PLCγ、ERK和NF⁃κB）以调节细胞存活、增殖、分化、迁移、黏附和凋亡^[8]。研究表明， Gas6通过诱导肿瘤相关巨噬细胞转化为免疫抑制的 M2 样表型促进癌症进展^[9-10]，这些肿瘤包括乳腺癌、肺癌^[11]、骨肉瘤、肝癌和肾细胞癌等，并且Gas6/Axl的表达水平与乳腺癌的不良临床结局相关^[9]。

据此，本研究通过染色质免疫沉淀（chromatin immunoprecipitation，ChIP）实验检测信号转导和转录激活因子 1（signal transducer and activator of tran⁃ scription 1，STAT1）是否与Gas6启动子结合，将含人 Gas6启动子或STAT1结合位点突变的Gas6启动子的萤光素酶报告质粒转染至 HEK⁃293T 细胞，同时敲低或过表达转录因子STAT1，应用双萤光素酶报告基因系统检测Gas6启动子的活性变化。在HEK⁃ 293T细胞中敲低或过表达转录因子STAT1，应用实时荧光定量 PCR 和蛋白质免疫印迹技术分别检测 Gas6 mRNA 和蛋白表达。本研究探讨了转录因子 STAT1对癌症相关基因Gas6的调控，为阐明Gas6在癌症中的作用和机制奠定了基础。

1 材料和方法

1.1 材料

人胚肾细胞（HEK⁃293T）、pRL⁃TK（海肾萤光素酶报告质粒）为本实验室保存；DMEM培养基（Gibco 公司，美国）；含 Gas6 启动子及点突变的 Gas6 启动子的萤光素酶报告质粒、STAT1 过表达质粒 pENTER⁃STAT1及pENTER、引物、STAT1的小干扰 RNA（small interfering RNA，siRNA）siSTAT1 及 siNC （南京擎科生物科技有限公司）；SDS⁃PAGE 凝胶配制试剂盒、Western blot 一抗二抗去除液（强碱性）、 ChIP检测试剂盒（上海碧云天生物技术有限公司）； RNA 提取试剂盒、去内毒素小量质粒提取试剂盒 （Omega公司，美国）；双萤光素酶报告基因检测试剂盒（Promega 公司，美国）；Gas6、GAPDH、STAT1 一抗及羊抗兔二抗（武汉三鹰生物技术有限公司）；总蛋白提取试剂盒（南京凯基生物技术股份有限公司）； 全DNA提取试剂盒（北京天根生化科技有限公司）。

1.2 方法

1.2.1 生信分析

用 GEO 数据库（https：//www.ncbi.nlm.nih.gov/ gds 和 https：//www.ncbi.nlm.nih.gov/geoprofiles）预测乳腺癌的高表达及低表达基因聚类分析结果；用 PROMO 数据库（http：//alggen.lsi.upc.es/cgi ⁃ bin/pro⁃ mo_v3/promo/promoinit.cgi?dirDB=TF_8.3）和JASPAR 数据库（https：//jaspar.genereg.net）预测 Gas6 启动子的转录因子结合位点；用 GEPIA 数据库（http：//ge⁃ pia.cancer⁃pku.cn）预测Gas6和STAT1在多种癌症中的相关性。

1.2.2 细胞培养

在37℃、5% CO₂培养箱中将HEK⁃293T细胞置于含1%青链霉素双抗和10%胎牛血清的DMEM高糖培养基中培养，2~3 d换液1次，细胞密度为85%~100%时传代或冻存，均使用对数期生长细胞。

1.2.3 ChIP实验

使用 ChIP 试剂盒，依据其说明书进行相关实验及分析。在 1%甲醛中固定 HEK⁃293T 细胞约 10 min，充分裂解细胞，超声剪切基因组 DNA 为 200~800 bp大小（去除交联并进行琼脂糖凝胶电泳观察DNA大小）。将合格样品分别进行特异性免疫沉淀并去除交联，选择相应引物进行 qRT ⁃ PCR 或 PCR，进行琼脂糖凝胶电泳实验并观察结果，相关引物见表1。

1.2.4 萤光素酶报告基因重组质粒的构建与鉴定

应用美国国立生物技术信息中心数据库NCBI （https：//www.ncbi.nlm.nih.gov/gene）查询人 Gas6 基因（GenBank 编号：NC_000013.11）转录起始位点 （transcription start site，TSS）上游1 400 bp、下游50 bp 的片段序列。将人 Gas6 基因的转录起始位点碱基编号为+ 1。将人 Gas6 启动子片段（-1 400~+50 bp）插入 pGL3⁃Basic 载体以构建质粒 pGas6⁃ 1450 并测序，应用 NCBI 的 blast（https：//blast.ncbi. nlm.nih.gov/Blast.cgi）工具鉴定该质粒。并以pGas6⁃1450 作为模板构建 STAT1 结合位点突变的启动子重组质粒，将其命名为 pGas6 ⁃ 1450 mut1、pGas6 ⁃ 1450 mut2、pGas6⁃1450 mut1+2（合称为 pGas6⁃1450 mut）并测序鉴定，突变序列见图1。

1.2.5 双萤光素酶报告基因实验

在96孔板中培养HEK⁃293T细胞（1×10⁴ 个/孔）， 24 h 后将待测质粒（100 ng）pGas6⁃1450 或 pGas6⁃ 1450 mut与pRL⁃TK质粒（4 ng）共同转染至细胞中，再培养24 h后检测启动子活性；将待测质粒和siRNA 50 nmol/L或过表达质粒（100 ng）与pRL⁃TK 质粒共同转染至细胞，检测敲低或过表达STAT1对启动子活性的影响；使用荧光光度计和双萤光素酶检测试剂盒检测启动子活性，启动子活性统一标准化为 pRL⁃TK的活性。结果重复3次及以上，siRNA序列见表2。

1.2.6 实时荧光定量PCR（qRT⁃PCR）

在12孔板中培养HEK⁃293T细胞（1×10⁵ 个/孔）。 24 h 后将 siRNA、过表达质粒和其对照试剂转染至细胞中，再培养24 h后检测敲低和过表达STAT1对 Gas6 mRNA 表达的影响。使用 Omega RNA 提取试剂盒提取细胞总 RNA，再将其均逆转录为第 1 链 cDNA，并进行 qRT⁃PCR 实验（反应条件：95℃ 10 min；95℃ 15 s、60℃ 30 s、72℃ 30 s，循环 40 次；95℃ 15 s，60℃ 1 min，95℃ 15 s）。该实验以 GAPDH 作为内参进行 3 次以上，并以 2^-ΔΔCt评估 mRNA相对表达水平，相关引物序列见表3。

1.2.7 Western blot实验

在6孔板中培养HEK⁃293T细胞（2×10⁵ 个/孔）， 24 h 后将 siRNA、过表达质粒和其对照试剂转染至细胞中，再培养48 h后使用总蛋白提取试剂盒提取细胞总蛋白，加入适量上样缓冲液后 100℃煮沸 10 min。制备 10% SDS⁃PAGE 凝胶，加样、电泳（电泳条件：80 V，30 min；150 V，40 min）并在快速转膜液中（转膜条件：常温恒流400 mA，30 min）将蛋白转至 PVDF膜，用快速封闭液室温摇床封闭30 min后4℃摇床孵育一抗10~12 h，TBST洗膜3次（20 min/次），室温摇床孵育二抗1 h，再洗膜后曝光显影。完成第一次化学发光检测后分别用蒸馏水、一抗二抗去除液、蒸馏水各漂洗 5 min 后进行封闭等后续操作以完成第二次化学发光检测。该实验以GAPDH作为内参并重复3次以上。

1.3 统计学方法

应用GraphPad Prism6与SPSS 25.0软件对实验数据进行统计分析。实验结果以均数±标准差（$\stackrel{-}{x}\pm s$） 表示，两组间比较采用t检验。P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 生信分析

应用GEO数据库分析得出乳腺癌的高表达（红色）及低表达（绿色）基因（图2A），其中Gas6属于高表达基因（图2B）；应用 PROMO 数据库和 JASPAR 数据库预测出转录因子STAT1与Gas6启动子有多个结合位点，以此设计了两个突变位点使Gas6不能与相应转录因子结合；应用 GEPIA 数据库分析 STAT1 和 Gas6 在多种癌症中的相关性，结果表明 STAT1与Gas6在多种癌症中有正相关趋势（P均＜ 0.05，图2C~E）。

2.2 转录因子STAT1与Gas6启动子结合

为探究 STAT1 是否与 Gas6 启动子结合，使用HEK⁃293T细胞进行ChIP实验，结果表明：STAT1抗体可沉淀结合在Gas6启动子上的蛋白，而阴性对照抗体IgG不能沉淀结合该启动子的蛋白，即转录因子STAT1在Gas6启动子上有结合位点（图3）。

2.3 点突变对人Gas6启动子活性的影响及STAT1 对Gas6启动子活性的影响

将pGas6⁃1450与pGas6⁃1450 mut进行测序并鉴定，结果显示与目标序列一致，表明含人Gas6启动子及STAT1 结合位点突变启动子的萤光素酶报告基因质粒构建成功。在工具细胞 HEK⁃293T 中进行双萤光素酶报告基因实验，结果表明：与 pGas6⁃ 1450组相比，pGas6⁃1450 mut1组的相对萤光素酶活性变化无统计学意义，而 pGas6 ⁃ 1450 mut2 组与 pGas6⁃1450 mut1+2组的相对萤光素酶活性均明显降低（P＜0.01，P＜0.05，图4A）；与相应对照组相比，pGas6⁃1450 组与 pGas6⁃1450 mut1 组在敲低或过表达 STAT1 后相对萤光素酶活性明显降低或升高（P＜0.05，P＜0.05），而 pGas6 ⁃ 1450 mut2 组与 pGas6⁃1450 mut1+2组在敲低或过表达STAT1后相对萤光素酶活性的变化差异无统计学意义（图4B、C）。

2.4 STAT1在mRNA水平对人Gas6基因的调控

为探究STAT1对人Gas6 mRNA表达的调控，在工具细胞 HEK⁃293T 中分别敲低和过表达 STAT1，并通过 qRT⁃PCR 检测 STAT1 的敲低效率和过表达效率，同时检测敲低 STAT1 与过表达 STAT1 后 Gas6 mRNA 表达的变化。结果表明：与 siNC 组相比，siSTAT1 组 STAT1 mRNA 表达显著降低（P＜ 0.01），同时 Gas6 mRNA 表达明显降低（P＜0.05，图5A）；与 pENTER 组相比，pENTER⁃STAT1 组 STAT1 mRNA表达显著升高（P＜0.01），同时Gas6 mRNA表达明显升高（P＜0.05，图5B）。

2.5 STAT1在蛋白水平对人Gas6基因的调控

为探究 STAT1 在蛋白水平对 Gas6 基因表达的调控，在 HEK ⁃ 293T 细胞中分别敲低和过表达 STAT1，通过Western blot检测STAT1敲低效率和过表达效率及 Gas6 蛋白表达的改变情况。结果表明：与 siNC 组相比，siSTAT1 组 STAT1 与 Gas6 的蛋白表达均明显降低（P＜0.05，P＜0.05，图6A、B）； 与 pENTER 组相比，pSTAT1 组 STAT1 与 Gas6 的蛋白表达均明显升高（P＜0.01，P＜0.05，图6C、D）。

3 讨论

真核生物基因的表达调控是多层次的，包括转录水平、转录后水平、翻译水平、翻译后水平的调控^[12]，是生物体内细胞分化、形态发生和个体发育的分子基础。基因转录水平的调控对研究相关疾病的分子机制及其预防、诊断、治疗等具有重要意义^[13]。而目前对Gas6基因的研究主要集中在蛋白水平，关于Gas6基因启动子的研究却很少。本研究通过ChIP实验证明转录因子STAT1可与Gas6启动子结合，同时对可能的潜在结合位点进行点突变，明确转录因子STAT1在Gas6启动子上的结合位点，同时通过敲低和过表达STAT1证明其在转录水平对Gas6基因进行调控。

生长抑制特异性基因（growth arrest ⁃ specific transcripts，GAS）家族成员众多，在细胞生长、分化、凋亡、细胞周期调控等方面具有重要功能。Gas6基因是GAS基因家族中的一员，它编码一种可刺激细胞增殖的蛋白质并在多种癌症中过度表达，被认为是预后不良的标志物之一。Gas6还与肥胖、肝纤维化、静脉血栓栓塞、系统性红斑狼疮、肾小球肾炎、慢性肾脏病、先兆子痫等疾病相关。大量研究表明 Gas6/Axl与多种癌症的侵袭性相关，包括乳腺癌、肺癌、胃肠癌、头颈部癌、肝细胞癌、肾细胞癌、胶质瘤、胰腺癌、甲状腺癌等，并在多种肉瘤、急性髓系白血病和其他血液系统恶性肿瘤中过表达^[14]。 Gas6蛋白通过激活癌细胞上的Axl受体，调节肿瘤微环境各组分（包括癌细胞、内皮细胞和免疫细胞）之间的细胞信号级联和细胞通讯，导致肝脏癌细胞转移性生长，并且诱导胰腺癌细胞的上皮⁃间充质转化，从而促进癌细胞在体内侵袭和扩散^[15]。研究表明，Axl 是针对耐药性和免疫抑制的重要分子靶标^[14]。

转录因子是控制细胞基因组表达的一类必不可少的蛋白质，已成为癌症研究和治疗的热点^[5]。 STAT家族成员被受体相关激酶磷酸化，形成同源或异源二聚体，这些二聚体在细胞核中作为转录激活因子介导多种基因的表达^[16]。STAT1属于STAT家族成员之一，该蛋白可被多种配体激活，包括干扰素⁃α、干扰素⁃γ和白介素⁃6等，在对病毒、真菌和分枝杆菌病原体的免疫反应中起重要作用^[17-18]。STAT1 通常被认为是肿瘤抑制因子，但有研究认为它也可以促进肿瘤发生^[19]，其在胃癌、结直肠癌中起致癌作用^[20]，并且与胃癌的免疫浸润和预后不良相关^[21]。由此可见，研究STAT1对探究相关疾病的分子机制具有重要意义。

本研究显示 STAT1 作为转录因子可与癌症相关基因 Gas6 启动子结合而在转录水平正向调控 Gas6的表达，为后续研究提供了新的思路和方向。

参考文献