卵巢癌是最致命的妇科恶性肿瘤，由于其发病隐匿，进展迅速，且缺乏有效的早期筛查手段，多数患者确诊时已为晚期。虽然免疫治疗是卵巢癌治疗的一个有前途的新领域，多种有希望的免疫治疗手段已被研发，但仍然需要克服免疫抑制性肿瘤微环境（tumor microenvironment，TME）以提高免疫治疗的疗效^[1-3]。TME中的免疫抑制是促进肿瘤生长与转移最为重要的前提条件之一，是肿瘤免疫治疗的主要障碍之一^[4]。免疫抑制性细胞及抑制因子是肿瘤免疫抑制微环境的重要组成部分，调节性 T 细胞（regulatory T cell，Treg）是其中的重要一员，通过不依赖于细胞接触（分泌抑制性细胞因子）或依赖于细胞接触（调节抗原呈递细胞功能和介导靶细胞的溶解或凋亡）的机制发挥免疫抑制功能，阻碍肿瘤特异性免疫反应^[5-7]。趋化因子⁃趋化因子受体 （C⁃C motif chemokine receptor，CCR）信号介导的募集作用是肿瘤内 Treg浸润的主要机制。研究显示有多个 CCR 通过与趋化因子配体（chemokine ligand， CCL）的结合，如 CCR4 ⁃ CCL17/22、CCR5 ⁃ CCL5、 CCR8⁃CCL1/18 和 CCR10⁃CCL28 等，参与招募 Treg 到 TME^[8-11]。与正常组织驻留及外周 Treg 相比，人肺癌、乳腺癌及大肠癌等肿瘤浸润性Treg上选择性高表达 CCR8^[12]。而 CCR8 在卵巢癌肿瘤浸润性 Treg 上是否高表达，CCR8⁺ Treg 是否是卵巢癌肿瘤浸润 Treg 的主要类型，相关问题尚未明确。因此，本研究以小鼠卵巢上皮癌细胞ID8构建的卵巢癌荷瘤C57BL/6小鼠模型为对象，分析CCR8在卵巢癌肿瘤浸润性Treg中的表达，及其对Treg分化的作用。

1 对象和方法

1.1 材料

C57BL/6小鼠卵巢上皮癌细胞ID8（深圳豪泰生物公司）；胎牛血清（杭州四季青公司）；青霉素⁃链霉素溶液、红细胞裂解液和DMSO溶液（上海碧云天生物公司）；高浓度基质胶（南京优宁维生物公司）； RPMI 1640 培养基（Hyclone 公司，美国），X⁃Vivo 15 培养基（Lonza公司，瑞士）；小鼠初始CD4⁺ T Cell提取磁珠（Miltenyi公司，德国）；AZ084（Med Chem Ex⁃ press 公司，美国）；CD3e 单抗、CD28 单抗（eBiosci⁃ence 公司，美国）；重组鼠 IL ⁃2（Peprotech 公司，美国）；TGF⁃β（R&D 公司，美国）；PE/Cyanine7 标记的抗小鼠 CD45、Brilliant Violet 510 标记的抗小鼠 CD3、FITC 标记的抗小鼠 CD4、PE 标记的抗小鼠 Foxp3、Brilliant Violet 421标记的抗小鼠CCR8、APC 标记的抗小鼠细胞毒性T淋巴细胞抗原4（cytotoxic T⁃lymphocyte antigen 4，CTLA⁃4）、APC 标记的抗小鼠程序性细胞死亡蛋白 1（programmed cell death protein 1，PD1）、APC标记的抗小鼠淋巴细胞激活基因3（lymphocyte⁃activation gene3，LAG⁃3）、APC标记的抗小鼠可诱导的 T 细胞共刺激分子（inducible T cell costimulator，ICOS）等流式抗体（Biolegend公司，美国）；Ⅳ型胶原酶（Gibco公司，美国）；Percoll细胞分离液、透明质酸酶、DNA酶Ⅰ、谷氨酰胺（Sigma公司，美国）。

1.2 方法

1.2.1 TCGA数据库、GTEx数据库分析

下载426例TCGA数据库中上皮性卵巢癌组织 （https：//portal.gdc.cancer.gov）与 88 例 GTEx 数据库中卵巢正常组织（http：//gepia.cancer ⁃ pku.cn/）的 RNA⁃seq 数据，以|Log₂TPM|>1 和 P＜0.05 为显著差异标准对趋化因子CCL1、CCL18作差异分析，并基于 R 包⁃GSVA[1.46.0]中提供的 ssGSEA 算法，计算各类免疫细胞：Treg、中性粒细胞、B 细胞、肥大细胞、Th17 细胞、Tgd细胞的浸润比例，使用Spearman 统计方法分析基因 CCR8[ENSG00000179934.7]与各免疫细胞的相关性，使用R包⁃ggplot2[3.3.6]对分析结果进行可视化。

1.2.2 小鼠皮下成瘤实验

本动物实验获得南京医科大学实验动物福利伦理委员会批准（IACUC⁃2303001）。20只C57BL/6 小鼠购自南京集萃药康生物科技公司。5×10⁶ 个ID8 细胞在复苏后经过3次传代培养，制备成100 μL细胞悬液，同时添加100 μL 20 mg/mL胶原蛋白的高浓度基质胶悬液，混匀后接种在小鼠腋下至侧腹的皮下部位，接种之后，小鼠仍置于SPF环境继续生长21 d后 CO2窒息处死，取脾脏、肿瘤组织、外周血样本。

1.2.3 小鼠样本处理

将脾脏组织碾磨后制备成单细胞悬液，使用红细胞裂解液分别分离出脾脏和外周血样本中的单个核细胞。将新鲜的小鼠皮下卵巢肿瘤组织剪成 1 mm3 的小块，在配制的原代组织消化液[RPMI⁃ 1640 培养基+胶原酶Ⅳ（1 μg/mL）+透明质酸酶 （100 ng/mL）+DNA 酶 Ⅰ（50 U/mL）+ 谷氨酰胺 （1 mmol/L）+1%青霉素⁃链霉素溶液]中 37℃消化 1 h 后 40 μm 滤器过滤，将过滤后细胞悬液使用 70% Percoll、30% Percoll梯度离心，得到单个核细胞悬液。

1.2.4 流式检测小鼠样本中Treg细胞上CCR8以及免疫检查点相关蛋白的比例

将小鼠脾脏、外周血、肿瘤组织的单个核细胞悬液铺在流式管底，加入PE/Cyanine7标记的抗小鼠 CD45、Brilliant Violet 510 标记的抗小鼠 CD3、FITC 标记的抗小鼠 CD4、PE 标记的抗小鼠 Foxp3、Bril⁃ liant Violet 421 标记的抗小鼠 CCR8、APC 标记的抗小鼠CTLA⁃4、APC标记的抗小鼠PDI、APC标记的抗小鼠 LAG⁃3、APC 标记的抗小鼠 ICOS 等流式抗体，经孵育、破核、洗涤、固定后使用Beckman Cytoflex流式仪进行检测。

1.2.5 体外诱导小鼠Treg细胞实验

雌性 C57BL/6 小鼠，6~8 周龄，体重 18~20 g。 2%戊巴比妥麻醉小鼠，无菌操作下取脾脏，碾磨匀浆分离脾脏细胞，裂解红细胞后得到单个核细胞，以磁珠提取初始 CD4 ⁺ T 细胞。圆底 96 孔板以 4 μg/mL CD3 单抗 4℃包被过夜后，加入 15 ng/mL hTGF⁃β、 30 U/mL鼠IL⁃2、2 μg/mL CD28单抗，将初始CD4⁺ T细胞以X⁃Vivo 15培养基调至1×10⁶ 个/mL铺在圆底96 孔板中，隔天半定量换液并传代。AZ084是一种强效的 CCR8 变构拮抗剂，其 Ki 值为 0.9 nmol/L，以DMSO作为溶剂溶解10 mg AZ084粉末，将其制备为AZ084储存液（5 mmol/L）。依据不同处理方式分为AZ084组、DMSO组与MOCK组。AZ084组在诱导过程中每日加入 5 μmol/L 的 CCR8 变构拮抗剂 AZ084，DMSO组在诱导过程中每日加入与AZ084组同体积的DMSO溶液，MOCK组为空白对照，只诱导分化不做其他任何处理。诱导培养3~5 d，流式检测 CD4⁺ Foxp3⁺ Treg细胞的比例。

1.3 统计学方法

所有数据使用 SPSS 25.0 统计软件进行数据分析，各组数据均以均值±标准差（$\stackrel{-}{x}\pm s$）表示，两组间的比较，符合正态分布的数据用独立样本 t 检验，多组间比较用单因素方差分析，非正态性分布数据采用 Mann⁃Whitney 检验。P＜0.05 为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 趋化因子CCL18在卵巢癌与癌旁组织中的表达存在显著差异

利用 TCGA 与 GTEx 公共数据库获取上皮性卵巢癌组织以及卵巢正常组织的RNA⁃seq数据，分析 CCL1 mRNA 与 CCL18 mRNA 在卵巢癌中的表达情况，发现CCL1基因在人类卵巢癌组织（n=426）与卵巢正常组织（n=88）中无明显差异（图1A），CCL18基因在人类卵巢癌组织中显著上调（非配对样本，P <0.05，图1B）。同时对 CCL1、CCL18 的受体 CCR8 作免疫浸润分析与Spearman相关性分析，绘制棒棒糖图（图2），结果显示CCR8基因与卵巢癌浸润的Treg 细胞具有高相关性（R=0.592，P＜0.05）。

2.2 CCR8 及免疫检查点相关蛋白 PD⁃1、CTLA⁃4、 LAG⁃3、ICOS在卵巢癌小鼠模型的肿瘤组织、外周血及脾脏中Treg上的表达情况

采用 CO₂窒息法处死 8 例 C57BL/6 卵巢癌荷瘤小鼠，对其皮下瘤模型进行瘤体大小测量，根据公式V=1/2× a×b²（a为长轴，b为短轴）计算得出肿瘤体积为800~1 200 mm³（图3）。采用流式细胞术（图4）检测 8 例荷瘤小鼠的肿瘤组织（图5）、外周血（图6）、脾脏（图7）的单个核细胞悬液中Treg 细胞上的 CCR8表达，结果显示小鼠肿瘤浸润性的CCR8⁺ Treg 占总Treg的比例为（74.3±13.2）%，而在小鼠脾脏、外周血中分别为（44.0±8.5）%、（16.9±7.8）%，小鼠肿瘤中浸润性 CCR8⁺ Treg 占总 Treg 的比例显著高于小鼠脾脏、外周血。小鼠外周血、脾脏、肿瘤中浸润性 CCR8⁺ Treg 中 PD⁃1⁺ 细胞亚群的比例分别为（16.4± 8.8）%、（50.0±16.4）%、（80.0±12.4）%，LAG⁃3⁺ 细胞亚群的比例分别为（11.3±6.9）%、（19.6±11.7）%、 （74.0±8.7）%，ICOS⁺ 细胞亚群的比例分别为（18.3± 10.5）%、（20.9±7.5）%、（72.3±6.8）%，CTLA⁃4⁺ 细胞亚群的比例分别为（13.5 ± 6.7）%、（26.1 ± 16.9）%、 （49.1±15.7）%。小鼠肿瘤浸润性CCR8⁺ Treg中PD⁃1⁺、 LAG⁃3⁺、ICOS⁺、CTLA⁃4⁺ 细胞亚群的比例显著高于脾脏和外周血（Mann⁃Whitney检验，P＜0.05，图8）。

2.3 体外实验中 CCR8 拮抗剂抑制小鼠的初始 CD4⁺ T细胞向Treg细胞的诱导分化

小鼠脾脏的初始 CD4⁺ T 细胞向 Treg 细胞诱导分化，结果显示 AZ084 组、DMSO 组、MOCK 组的 Treg 细胞分化比例分别为（29.1 ± 8.8）%、（52.2 ± 9.6）%、（70.6±16.7）%，AZ084 组与 DMSO 组、MOCK 组差异均有统计学意义（P＜0.05，图9）。

3 讨论

卵巢癌是病死率最高的妇科恶性肿瘤，虽然治疗方法不断改进，但是卵巢癌患者的生存率并没有明显提高。近年来免疫治疗逐渐显示出巨大潜力。TME 的复杂性和多样性对免疫治疗的效果具有重要影响。深入阐明卵巢癌免疫抑制微环境的产生机制，探索提高免疫治疗效果的新策略是卵巢癌治疗的研究方向。卵巢癌免疫抑制微环境形成的主要机制之一是 Treg 细胞抑制 CD8⁺ 效应性 T 细胞杀伤肿瘤的功能。肿瘤浸润性Treg高度活化、增殖，具有很大的异质性^[13]，而趋化因子和细胞因子依赖的募集是 Treg 细胞向肿瘤浸润的主要机制。如趋化因子CCL1和CCL18，由肿瘤细胞和TME内的树突状细胞分泌，与Treg细胞上的CCR8受体结合，引导它们向肿瘤部位移动^[14-15]。细胞因子IL⁃2，通过与 Treg细胞表面上的CD25（IL⁃2受体的α链）结合，能够促进 Treg 细胞的活性和增殖。在一些肠癌模型中，通过增加IL⁃2的浓度可以显著增加Treg细胞在 TME中的数量^[16]。因此，在抗肿瘤免疫治疗中，Treg 细胞的调节和耗竭策略被认为是有效的方法。然而，由于缺乏对肿瘤浸润性Treg群体的良好选择性，这些策略往往导致严重的不良反应^[17]。因此需要开发一种针对肿瘤浸润性 Treg 细胞的特异性靶向标志物。

本研究发现在小鼠模型中，CCR8 作为卵巢癌最稳定和差异表达的趋化因子受体，CCR8⁺ Treg是卵巢癌浸润性Treg的主要类型，CCR8⁺ Treg中PD⁃1⁺、 CTLA⁃4⁺、ICOS⁺、LAG⁃3⁺ 亚群也显著高于脾脏和外周血液，提示CCR8⁺ Treg可能是卵巢癌主要的浸润性 Treg，在肿瘤免疫抑制微环境中发挥主导作用，其抑制性与共刺激性的亚群都比外周组织中更活跃，因此可能在卵巢癌免疫逃逸中发挥作用。同时，CCR8 变构拮抗剂 AZ084 明显抑制初始 CD4 ⁺ T 细胞向 Treg细胞的诱导分化。最新研究也显示，在人类乳腺癌、肺癌、结肠癌、肝癌以及小鼠黑色素瘤、非小细胞肺癌等模型中，肿瘤浸润性 Treg 细胞上的 CCR8 表达增高^[18]，与本研究的结论基本一致。因此靶向卵巢癌浸润性 CCR8 ⁺ Treg，选择性地清除 CCR8⁺ Treg或抑制其功能，可控制或改善TME的免疫抑制状态，有利于提高卵巢癌免疫治疗的疗效。但目前研究暂不足以说明CCR8对肿瘤浸润性Treg 发挥功能具有必要性，后续将进一步研究直接敲除 Treg上的CCR8基因对肿瘤浸润性Treg免疫表型与功能的影响以及CCR8⁺ Treg功能调控的分子机制，从而为卵巢癌的靶向免疫治疗提供更精准的分子诊断依据。

参考文献