辅酶Q（coenzyme Q，CoQ）是一种由苯醌环和类异戊二烯链组成的脂质分子，广泛分布于所有真核细胞的细胞膜中。异戊二烯的长度可因物种不同而改变，6个异戊二烯形成酵母的辅酶Q6（CoQ6），8个异戊二烯形成大肠杆菌中的辅酶 Q8（CoQ8），10 个异戊二烯形成人类的 CoQ10^[1-2]。CoQ10 可以接受或提供电子或质子，并以氧化形式（泛醌）、还原形式（泛喹啉、泛醇）和自由基中间体（泛半醌自由基） 存在。CoQ10作为线粒体电子传递链中关键的电子载体，可以将复合体Ⅰ和复合体Ⅱ的电子转移到复合体Ⅲ，是细胞生物能量供应必不可少的组成成分。CoQ10还可以作为一种抗氧化剂参与连续的氧化还原反应，调控细胞内的氧化还原平衡^[3]。

辅酶Q生物合成蛋白4同系物（coenzyme Q bio⁃ synthesis protein 4 homolog，COQ4）编码基因COQ4位于人类9号染色体34.13位点上。COQ4在人体所有组织中广泛表达，是CoQ10生物合成所必需的基因^[4]，其突变可以引起多种与CoQ10相关的线粒体疾病^[5-7]。

胎盘在胎儿出生前起着至关重要的作用，其发育缺陷会引起先兆子痫、胎儿生长受限、流产等多种妊娠相关并发症^[8-9]。在哺乳动物发育早期，囊胚包含内细胞团（inner cell mass，ICM）和滋养外胚层 （trophectoderm，TE）^[10]。ICM 分化形成外胚层和原始内胚层，产生胚胎和胚外组织。TE进一步发育成为极滋养外胚层（polar trophectodermal，pTE）和壁滋养外胚层（mural trophectodermal，mTE）。囊胚在植入子宫内膜后，于胚胎日（embryonic day，E）6.5 d（E6.5） 开始形成原肠胚，pTE形成胚外外胚层^[11]。原肠胚形成结束时胚外外胚层与胚外中胚层形成绒毛膜，并通过胚外体腔与外胚层分离。E8.5 时中胚层衍生的尿囊附着并与绒毛膜基底层融合，经过绒毛膜滋养层细胞的侵袭和分化，最终形成对母胎营养和气体交换至关重要与功能完全的胎盘^[12-13]。

据报道，COQ4的研究主要集中在人类患者上，目前还没有哺乳动物小鼠体内的相关研究，并且 Coq4 基因突变的具体致病机制仍未完全清楚。因此为了研究Coq4的生理功能以及其缺失导致的致病原因，本研究引进Coq4敲除小鼠模型，首次对其表型进行研究。

1 材料和方法

1.1 材料

以C57BL/6 为背景的 Coq4 全身杂合突变小鼠 （Coq4^+/-）分别从江苏省集萃药康生物有限公司 （B6/JGpt⁃Coq4^em2Cd3877/Gpt）和剑桥⁃苏大基因组资源中心[C57BL/6N⁃Coq4^{tm1a（EUCOMM）Wtsi}/Cmsu]获得（图1）。这两种来源的 Coq4 ^+/-小鼠分别杂交形成 Coq4 纯合 （Coq4^-/-）胚胎和野生型（wild type，WT）胚胎基因一致。

本研究所用动物均按照《南华大学小鼠福利和伦理条例》分笼饲养，喂养条件参照本课题组文献^[14]，具体为24 h明暗交替（明，8：00—20：00；暗，20：00— 8：00），环境温度（23±2）℃，相对湿度55％~60％，自由饮食进水，定期更换垫料补充饲料以及饮水。

1.2 方法

1.2.1 杂交后代统计

采用江苏省集萃药康生物有限公司Coq4^+/-小鼠 （12只）以及剑桥⁃苏大基因组资源中心Coq4^+/-小鼠 （8只）作为F0代进行配繁，对出生1周龄的F1代小鼠标记，并进行杂交后代概率统计并记录。

1.2.2 基因型鉴定

剪取 0.2 cm 胚胎组织提取 gDNA，进行 PCR 分析（P112-01，南京 Vazyme 公司）。使用引物序列 （Coq4⁃WT⁃F：5′⁃CAGGATTCTCAGTTAGGGTATGT⁃ GC ⁃ 3′；Coq4 ⁃ WT ⁃ R：5′ ⁃ CACAACCTCTCCTAGC⁃ GATAAGGA⁃3′）从野生型等位基因中扩增685 bp的条带。使用引物序列（Coq4⁃KO⁃F：5′⁃GTCAGCTTC⁃CGTGTAAGCTGAAG ⁃ 3′；Coq4 ⁃ KO ⁃ R：5′ ⁃ GATGT⁃ GACAAGCTCCCATTCTAACT ⁃3′）从敲除的等位基因中扩增 611 bp 的条带。扩增程序：95℃ 5 min； 95℃ 30 s，57℃ 30 s，72℃ 30 s，32个循环；72℃ 7 min。

1.2.3 组织切片及HE染色

采用江苏省集萃药康有限公司的 Coq4^+/-雌雄小鼠，以 2∶1 的比例于前一天下午 6 点左右放到同一个鼠笼中，次日早晨进行检栓，并将见栓母鼠内的胚胎记为 E0.5。分别在胚胎 E6.5（6 只）、E7.5 （8 只）、E8.5（8 只）、E9.5（8 只）、E10.5（6 只）、E11.5 （6只）取出母鼠子宫，剥离母体子宫外膜后，进行后续组织学分析。将解剖好的组织放至4%多聚甲醛中4℃过夜，脱水处理后包埋到石蜡中，并按一定方向切片。切片平均厚度为7 μm，于清水中展片后黏附于载玻片上，放至37℃烘箱烘干。

组织切片观察采用苏木素和伊红（hematoxylin and eosin，HE）染色，首先在二甲苯中进行3次脱蜡，然后用 100％→50%的乙醇进行梯度复水，苏木素染色 2 min，氨水反蓝 30 s，接着又用 50％→90％的乙醇进行脱水，伊红染色3 min后使用100%乙醇脱水后，放入二甲苯中短暂浸泡，长期保存可以使用中性树胶封片。

1.2.4 免疫荧光

对江苏省集萃药康生物有限公司来源繁育的6个小鼠胚胎（WT3个，Coq4^-/- 3个）组织脱蜡，进行柠檬酸钠抗原修复，PBS 清洗 4 次，免疫组化笔画圈，山羊血清室温封闭 1 h，Tpbpa（稀释比例为 1∶500）一抗 4℃过夜。第 2 天取出恢复室温，PBS 清洗 4 次，对应二抗（稀释比例为1∶200）室温孵育1 h，甘油封片，放至-20℃冰箱等待拍片。

1.3 统计学方法

统计分析与统计图均采用Graphpad Prism 5进行计算与制作，数据以均值±标准差（$\stackrel{-}{x}\pm s$）表示，两组数据的比较采用成组t检验，P <0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 Coq4敲除小鼠的基因型鉴定

通过 PCR 实验鉴定小鼠胚胎的基因型，WT 胚胎仅出现 1 条分子量为 685 bp 的条带，Coq4^-/-胚胎仅出现1条611 bp的条带，Coq4^+/-胚胎出现685 bp及 611 bp两个条带（图2A）。根据条带出现情况可以判断，346⁃2、346⁃4、346⁃6 号小鼠胚胎的基因型为 Coq4^+/+，346⁃3、346⁃5号小鼠胚胎的基因型是Coq4^+/-，346⁃1 号小鼠胚胎的基因型是 Coq4^-/-。为了检验 Coq4 全敲小鼠模型的敲除效率，将 WT 和 Coq4^-/-小鼠的胎盘进行RNA⁃seq。结果表明Coq4在WT小鼠胎盘中有表达，而在同窝Coq4^-/-小鼠的胎盘中没有观察到Coq4的表达（图2B），这证明Coq4全身敲除小鼠模型成功构建。

2.2 Coq4敲除小鼠胚胎胎盘发育严重迟缓

对Coq4^+/- 小鼠杂交后代进行基因型概率统计，发现 F0 代亲本产生的 F1 代小鼠 3 种基因型+/+、+/-、-/-的比值约为1∶2∶0，即未能从F1代鉴定出 Coq4^-/-基因型幼鼠，表明 Coq4^-/-小鼠在出生前已经死亡（表1）。

为了确定胚胎死亡的具体时间，对怀孕小鼠不同时期的胚胎进行解剖和基因分型。发现自 E7.5 原肠胚形成时期，Coq4^-/-外胎盘椎（ectoplacental cone，epc）面积明显减少（图3A~C），胚胎大小与WT 小鼠胚胎相比差异显著（图3D~F）。

WT 小鼠胚胎 E8.5 时原肠胚形成结束，E9.5 时胚胎回转，绒毛膜尿囊形成（图4D）。与之相比， Coq4^-/-组胚胎结构异常。呈现出与E8.5胚胎大小基本一致的表型（图4E、F、图3K、L），且Coq4^-/-小鼠胎盘出现了明显缺陷（图4B、C）。

E10.5 WT小鼠胚胎各器官开始形成，胎盘发育也趋近完整（图4G、J）。Coq4^-/-胚胎出现明显器官发育障碍，形态维持在原肠形成时期（图4K、L），胎盘缺失明显（图4H、I）。

同时将小鼠E7.5至E10.5胚胎连母体蜕膜同时固定、切片并用HE染色对胚胎进行进一步组织学观察。结果显示，E7.5 Coq4^-/-胚胎在胚外外胚层以及胚胎胚层还未分化的阶段开始出现异常（图5B、C）。 Coq4^-/-胚胎于E8.5和E9.5才逐渐出现绒毛膜板、尿囊等E7.5 WT型胚胎出现的发育结构（图5E、F、H、I）。 E10.5和E11.5 Coq4^-/-胚胎组织几乎不可见，并且组织明显破碎（图5K、L、N、O）。上述结果表明Coq4^-/-胚胎出现严重的发育迟缓。

接着本研究重点对 E8.5 之前的胚胎进行观察。在 E6.5 阶段，正常胚胎开始进行原肠胚形成，胚胎显示出良好的胚外外胚层、胚胎外胚层和内胚层结构，此时 Coq4^-/-胚胎也表现出相同的结构 （图6A、B）。E7.5 时 WT 胚胎内胚层、中胚层、外胚层 3 层结构建立，并伴随着出现胎盘外腔、胚外体腔、羊膜腔 3 个特征性腔。此外，来源于胚外外胚层的绒毛膜结构也随之出现。然而在这个阶段，尽管 Coq4^-/-胚胎确实显示出胚胎的 3 层结构，但胚外结构变形，绒毛膜板、胚外体腔、胎盘外腔均发育异常，epc区域也显著减少（图6C、D）。

综上所述，Coq4^-/-胚胎在原肠胚形成阶段发育停滞，并在器官形成阶段死亡。组织形态学观察结果表明Coq4基因对小鼠早期胚胎的发育至关重要。

2.3 Coq4敲除小鼠滋养层细胞侵袭能力减弱

为了进一步表征Coq4^-/-胚胎的形态缺陷，使用滋养层细胞特异性标志物Tpbpa对E8.5胚胎的切片进行免疫荧光染色。Tpbpa在epc中表达，然后延伸到海绵滋养层细胞中。E8.5时HE结果显示8个胚胎中有2个胚胎异常发育，免疫荧光结果显示WT胚胎中Tpbpa阳性细胞主要定位于epc上。相比之下， Coq4^-/-胚胎的Tpbpa阳性细胞表达量明显减少，且不均匀地散布于胚胎周围（图7A、B）。这一结果再次表明Coq4敲除导致小鼠胎盘发育不良。

3 讨论

本研究证明了Coq4在小鼠早期胚胎发育过程中发挥着重要作用，完全的Coq4基因缺失导致绒毛膜板形成缺陷。组织学和细胞特异性标志物免疫荧光染色结果进一步表明细胞增殖能力下降，滋养层细胞浅层侵袭，胚胎早期生长迟缓和原肠胚形成期胚胎致死。

笔者课题组早期研究发现 Coq4 受到 SRCAP 重构复合物的直接调控，猜测 Coq4 可能影响早期胚胎心脏发育^[15]。但本研究发现Coq4 ^⁃/⁃小鼠胚胎于 E7.5 原肠胚形成阶段就开始出现发育异常。基于 Perez⁃Garcia 等^[16] 对数据库中胚胎致死的基因进行大规模胎盘表型筛查分析的结果，猜测 Coq4 敲除后胎盘缺陷是导致小鼠胚胎发育性死亡的关键因素。

在人群中对Coq4基因突变家系进行调查也发现，该基因突变可以引起致命的新生儿线粒体脑肌病^[17]。基于Coq4在早期胚胎发育中的表型及其缺失在人类中会引起线粒体心脑病的现象^[18]，Coq4全敲小鼠的早期胚胎中可能存在线粒体功能或代谢相关紊乱，导致Coq4全敲小鼠胚胎在原肠胚形成上的缺陷。

Coq4基因主要参与CoQ10的生物合成，本研究主要集中在小鼠Coq4基因缺失引起的胚胎发育表型改变，但Coq4通过何种机制引起胚胎以及胎盘发育障碍尚不明确。Coq4 作为 CoQ10 合成的关键催化酶，其基因缺失可能通过影响线粒体电子传递链引起能量供应障碍。但有研究发现，胚胎植入后，能量供应主要通过糖酵解^[19-20]，CoQ10 相关通路是否是Coq4基因缺失引起胚胎致死的主要原因仍需深入探讨。同时寻找Coq4具体作用机制也是下一步的研究方向之一。综上所述，小鼠全身Coq4敲除后胎盘和原肠胚形成障碍，Coq4为胚胎发育所必需。

致谢：

感谢“剑桥⁃苏大基因组资源中心”对本研究的支持。

参考文献