炎症小体是由多种蛋白质组成的复合体，是天然免疫系统的重要组成部分^[1-2]。其中核苷结合寡聚化结构域样受体4（nucleotide⁃binding oligomeriza⁃ tion domain⁃like receptor 4，NLRC4）作为最重要的炎症小体之一，能够感知一系列胞内细菌的感染，在先天免疫反应中发挥关键作用^[3]。当宿主细胞受到鼠伤寒沙门氏菌感染之后，该菌利用其3型分泌系统（type3 secretion system，T3SS）将杆状蛋白（Prgj） 以及鞭毛蛋白（Flagellin，FLIC）释放到胞内，与核苷酸结合富含亮氨酸重复受体（nucleotide⁃binding leu⁃ cine⁃rich repeat⁃containing receptor，NLR）家族凋亡抑制蛋白（NLR family of apoptosis inhibitory protein， NAIP）相互作用并激活它们。诱导NAIP⁃NLRC4炎症小体的组装，激活Caspase⁃1，促进白细胞介素（inter⁃ leukin，IL）⁃1β以及 IL⁃18 的成熟，同时剪切 Gasder⁃ min D（GSDMD）介导细胞焦亡^[4-5]。与 NLR 家族蛋白成员一样，NLRC4具有典型的3种结构域，包括 N 末端半胱天冬酶激活和募集结构域（Caspase⁃acti⁃ vation and recruitment domain，CARD）、中央 NACHT 核苷酸结合结构域和 C 末端富含亮氨酸重复序列 （Leucine⁃rich repeat，LRR）结构域^[6]。NLRC4 炎症小体的激活需要NAIP蛋白参与，其可以感知胞质中的细菌成分。虽然NLRC4炎症小体的特异性配体已经有大量研究，但是NAIP⁃NLRC4炎症小体组装的上游调节因子仍不明确。

TANK 结合激酶 1（TANK ⁃ binding kinase1， TBK1）首先被鉴定为与小鼠中的 TANK 相互作用的蛋白^[7]，其不仅在核因子κB（nuclear factor⁃kappa B， NF⁃κB）介导的应答中起作用，还在干扰素调节因子 （interferon regulatory factor，IRF）的激活中发挥重要作用^[8]。事实上，TBK1已被证明在炎症和自噬等多种细胞通路中具有关键作用^[9-10]。随着对其结构及功能的深入研究，TBK1已成为治疗炎症性疾病、自身免疫性疾病、癌症、代谢性疾病和神经退行性疾病的潜在靶点^[11-13]。由此可见，TBK1是多种炎症途径和多种干扰素诱导途径的交叉点^[14]。最近有研究表明TBK1可以参与调节NOD样受体热蛋白结构域相关蛋白 3（NOD ⁃like receptor thermal protein domain associated protein 3，NLRP3）炎症小体的激活^[9，15]。

本研究利用鼠伤寒沙门氏菌（Salmonella typhimurium，S.T）处理永生化骨髓巨噬细胞（immor⁃ talized bone marrow⁃ derived macrophage，IBMDM），构建 NLRC4 炎症小体急性炎症感染模型，通过抑制 TBK1的表达及功能以观察TBK1在NLRC4炎症小体信号通路中的作用。

1 材料和方法

1.1 材料

胰蛋白胨、酵母提取物（Oxiod 公司，美国）；琼脂粉（北京Solarbio公司）；氨苄青霉素（Sigma公司，美国）；TBK1 抑制剂 GSK8612（Med ChemExpress 公司，美国），TBK1抑制剂氨来呫诺（Amlexanox，AML） （Abcam公司，美国）；DSS交联剂（MCE公司，美国）， DMEM、RPMI1640培养基（Gibco公司，美国）；TMD显色试剂、小鼠肿瘤坏死因子（tumor necrosis factor， TNF）⁃α ELISA 试剂盒、小鼠 IL ⁃1β ELISA 试剂盒 （BD Biosciences公司，美国），胶回收试剂盒（Omega Biotek公司，美国），质粒小提试剂盒（南京诺唯赞生物科技有限公司），乳酸脱氢酶（lactate dehydroge⁃ nase，LDH）检测试剂盒（上海碧云天生物技术公司）。

Anti⁃NLRC4、Anti⁃p⁃NLRC4、Anti⁃GSDMD、Anti⁃ Myc、Anti⁃Flag（Abcam公司，美国），Anti⁃凋亡相关斑点样蛋白（apoptosis ⁃ associated speck ⁃ like protein containing a CARD，ASC）（Santa Cruz 公司，美国），Anti ⁃Caspase ⁃1（AdipoGen 公司，美国），Anti ⁃p ⁃Ser （Santa 公司，美国），Anti⁃TBK1（CST 公司，美国）， Anti ⁃ p ⁃ TBK1（武汉 ABcolond 公司），Anti ⁃GAPDH （Proteintech 公司，美国）；Cy3 标记的山羊抗兔 IgG （H+L）、FITC 标记的山羊抗鼠 IgG（H+L）（Jackson ImmunoResearch，美国），HRP 标记的山羊抗兔 （H+L）、HRP 标记的山羊抗鼠（H+L）（北京中杉金桥公司），APC⁃CD11b、PE⁃Ly6G（eBioscience 公司，美国）。

质粒：pcDNA3.1 ⁃ Flag ⁃ TBK1、pcDNA3.3 ⁃ Myc ⁃ TBK1、pcDNA3.3⁃Myc ⁃TBK1⁃N 端、pcDNA3.3⁃Myc ⁃ TBK1⁃C端、pcDNA3.1⁃Flag⁃TBK1Ser172A、pcDNA3.1⁃ Flag⁃TBK1Ser172D、pgex6p1⁃GST⁃TBK1、pet28a⁃HIS⁃ NLRC4、pcDNA3.3 ⁃ Myc ⁃ NLRC4、pcDNA3.3 ⁃ Myc ⁃ NLRC4 ⁃ΔCARD、pcDNA3.3 ⁃ Myc ⁃ NLRC4 ⁃ NACHT、 pcDNA3.3⁃Myc⁃NLRC4⁃LRR、pcDNA3.3⁃Myc⁃NLRC4 Ser533A、pc⁃DNA3.3⁃Myc⁃NLRC4 Ser533D由本实验室构建。pcDNA3.1⁃Flag⁃NLRC4、pet28a⁃LFN ⁃FLIC 由北京生命科学研究院邵峰实验室赠送。shTBK1 由本实验构建。

S.T 菌株 SL1344，小鼠胚胎成纤维细胞 Cre⁃J2、小鼠成纤维细胞L929、人胚胎肾细胞HEK293T和小鼠单核巨噬细胞白血病细胞RAW264.7购自美国模式培养物集存库（American type culture collection， ATCC），IBMDM为本实验室保存。

6~8周龄的C57BL/6雄性小鼠由南京医科大学实验动物中心提供。动物实验严格遵循实验动物饲养及操作规范，由南京医科大学实验动物福利伦理委员会审核（IACUC⁃2003010）。

1.2 方法

1.2.1 骨髓巨噬细胞的分离与IBMDM的诱导

提前将 Cre ⁃J2 细胞复苏，用含 20%血清的 DMEM在75 cm² 细胞培养瓶中培养。待铺满75 cm² 细胞瓶且培养 48 h 后收细胞上清，使用 0.45 μm 滤器进行过滤，细胞上清冻存于-80℃，备用。将 L929 细胞复苏，使用含10%血清的DMEM在75 cm² 细胞培养瓶培养7 d后，收细胞上清，使用0.45 μm滤器过滤，细胞上清冻存于-80℃，备用。

C57BL/6 小鼠麻醉后脱臼处死，75%乙醇消毒小鼠皮肤3 min。在超净台中取出双下肢的胫骨及股骨，使用75%乙醇浸泡消毒30 s，移入4℃ 1×PBS 中浸泡，剪去骨头两端，暴露骨髓腔，使用 1 mL 注射器吸4℃ RPMI 1640 培养基将骨髓从股骨、胫骨中吹出，反复吹打，使细胞团块分散，使用 70 μm 滤器过滤后，转移至 15 mL 离心管内，1 500 r/min离心 5 min，弃上清，加入红细胞裂解液重悬，静置 5 min 后，1 500 r/min 离心 5 min，弃上清，用 1 mL 含 10% 血清的DMEM完全培养基重悬骨髓细胞，将细胞混悬液加入至 25 cm² 培养瓶中，随后加入含有 1 mL L929 细胞培养上清、2.5 mL Cre⁃J2 细胞培养上清、 5 μL浓度为8 mg/mL 的Polybrene 和500 μL完全培养基的诱导培养基，于37℃ 5% CO₂细胞培养箱中培养，隔天更换诱导培养基，5 d 后，使用完全培养基继续培养细胞，直到细胞增殖，获得IBMDM。

1.2.2 shTBK1敲减实验

在室温下，将 PolyJet^TMReagent 转染试剂（3 μL）与 1 000 ng/μL 的 shTBK1（1 μL）混合于 100 μL 的 DMEM 中并静置 15 min，随后滴加到 RAW264.7 细胞中，37℃继续培养48 h。

1.2.3 S.T菌株SL1344的培养及刺激方法

在无菌 15 mL 离心管中，用 5 mL LB 液体培养基（无抗生素）于 37℃培养 S.T 菌株 SL1344 12 h。 1∶100比例稀释菌液，于37℃继续培养3 h。随后吸取1 mL菌液，在室温下，5 000 r/min离心5 min，弃上清，用2 mL无菌PBS重悬。吸取 S.T菌株SL1344悬液（MOI：50）滴加到待刺激的 IBMDM 或 RAW264.7 细胞中，混匀，37℃刺激2 h后收集细胞培养上清以及细胞裂解液备用。

1.2.4 LDH检测

收集 S.T（MOI：50）刺激后的 IBMDM 或 RAW264.7细胞培养上清，400 g离心5 min。按LDH 检测试剂盒操作说明检测。

1.2.5 Western blot实验

通过 RIPA 裂解缓冲液（0.225 mol/L Tris⁃HCl、 50%甘油、5%SDS和0.05%溴酚蓝）或Loading buffer 从 IBMDM、RAW264.7或HEK293T细胞中提取总蛋白。BCA法用于检测蛋白质浓度。每个样品取20 μg 蛋白质进行 SDS⁃PAGE 分离，然后转移到 PVDF 膜上。5%脱脂牛奶封闭后，使用相应的一抗（Caspase⁃1、 GSDMD、GAPDH、p⁃TBK1、p⁃NLRC4等）在4℃下孵育过夜，室温下相应二抗孵育 1 h。通过化学发光试剂和化学发光成像系统获得图像。

1.2.6 S.T鞭毛毒力蛋白FLIC的制备和纯化

将质粒pet28a⁃LFN⁃FLIC转化到大肠杆菌BL21 中培养，37℃过夜。挑取单克隆菌落于液体LB培养基中，37℃下振荡过夜。将细菌溶液以1∶100的比例接种到 LB 中，37℃下培养。当 D（600 nm）为 0.5~0.7时，将0.5 mmol/L 异丙基β⁃D⁃1⁃硫代吡喃半乳糖苷（IPTG）加入到细菌溶液中，并在 22℃下诱导表达 12 h。 4℃ 3 000 r/min 离心 20 min 后收集菌体。超声波裂解后，按照 HIS 标签蛋白纯化试剂盒的说明获得纯化的FLIC蛋白。

1.2.7 毒力蛋白激活NLRC4炎症小体

在室温下，将 PolyJet^TMReagent 转染试剂（3 μL） 与含有 5 μg/mL 的 FLIC 蛋白溶液（20 μL）混合于 100 μL DMEM中并静置15 min，随后滴加到IBMDM 细胞中，37℃继续培养 24 h。收集细胞培养上清，使用 Loading buffer 裂解细胞，收集细胞裂解液，进行Western blot检测，方法同1.2.5。

1.2.8 重组 GST⁃TBK1 及 HIS⁃NLRC4 蛋白的制备、纯化及GST pull⁃down

将含有 TBK1 和 NLRC4 的重组质粒 pgex6p1⁃ GST ⁃ TBK1、pet28a ⁃ HIS ⁃ NLRC4 转化到大肠杆菌 BL21中。使用0.1 mmol/L IPTG在20℃下诱导重组蛋白GST⁃TBK1表达12 h；0.5 mmol/L IPTG诱导HIS⁃ NLRC4表达14 h。按照GST标记蛋白质纯化试剂盒或 HIS 标记蛋白质纯化试剂盒提供的说明进行纯化。将纯化的蛋白质混合在同一离心管中，孵育过夜后，加入镍柱或谷胱甘肽磁珠混合2 h，再用1×PBST （含有1% TritonX⁃100）洗涤磁珠3次以去除抗原非特异性结合，样品用2×Loading buffer重悬，并在95℃下煮沸5 min，进行Western blot检测，方法同1.2.5。

1.2.9 免疫共沉淀（co⁃immunoprecipitation，Co⁃IP） 实验

检测TBK1是否与NLRC4相互作用：将pcDNA3.1⁃ Flag⁃NLRC4、pcDNA3.3⁃ Myc⁃TBK1 在 HEK293T 中过表达 16 h。然后用含有 1%蛋白酶抑制剂 PMSF 的 RIPA 裂解液裂解细胞，4℃下以 12 000 r/min 离心10 min，收集上清。加入Anti⁃Myc或Anti⁃Flag 抗体，4℃下过夜，加入蛋白 A/G 磁珠混合 1 h，然后用 1×PBST（含有 1% TritonX⁃100）洗涤磁珠3次，将 Co⁃IP 样品用 2×Loading buffer 重悬，并 95℃煮沸 5 min。后续加入一抗Anti⁃Flag、Anti⁃Myc及相应二抗进行Western blot检测。

检测TBK1与NLRC4的结合区域：将pcDNA3.1⁃ Flag⁃TBK1、pcDNA3.3⁃Myc⁃NLRC4、pcDNA3.3⁃Myc⁃ NLRC4 ⁃ΔCARD、pcDNA3.3 ⁃ Myc ⁃ NLRC4 ⁃ NACHT、 pcDNA3.3⁃Myc⁃NLRC4⁃LRR；pcDNA3.3⁃ Myc⁃TBK1、 pcDNA3.3⁃Myc⁃TBK1⁃N 端、pcDNA3.3⁃Myc⁃TBK1⁃C 端、pcDNA3.1⁃Flag⁃NLRC4 在 HEK293T 中过表达 16 h，Co⁃IP方法同上，后续加入一抗Anti⁃Flag、Anti⁃ Myc、Anti⁃TBK1及相应二抗进行Western blot检测。

检测 TBK1 的酶活性是否影响与 NLRC4 的相互作用：将 pcDNA3.1⁃Flag ⁃TBK1、pcDNA3.1⁃Flag ⁃ TBK1Ser172A、pcDNA3.1 ⁃ Flag ⁃ TBK1Ser172D、pcD⁃ NA3.3⁃Myc⁃NLRC4在 HEK293T中过表达16 h，Co⁃IP 方法同上，后续加入一抗Anti⁃Flag、Anti⁃Myc及相应二抗进行Western blot检测。

检测NLRC4 Ser533位点的磷酸化水平是否影响与TBK1的作用：将pcDNA3.1⁃Flag⁃TBK1、pcDNA3.3⁃ Myc ⁃ NLRC4、pcDNA3.3 ⁃ Myc ⁃ NLRC4 Ser533A、 pcDNA3.3⁃Myc⁃NLRC4 Ser533D在 HEK293T中过表达 16 h，Co⁃IP 方法同上，后续加入一抗 Anti⁃Flag、 Anti⁃Myc及相应二抗进行Western blot检测。

1.2.10 免疫沉淀（immunoprecipitation，IP）实验

为了检测TBK1是否磷酸化NLRC4，将pcDNA3.1⁃ Flag⁃TBK1、pcDNA3.3⁃Myc⁃NLRC4、pcDNA3.3⁃Myc⁃ NLRC4 Ser533A在 HEK293T中过表达16 h后，用含有 1%蛋白酶抑制剂 PMSF 的 RIPA 缓冲液裂解细胞，4℃ 12 000 r/min 离心 10 min，收集上清。加入 Anti⁃Myc抗体，4℃过夜，加入蛋白 A/G 磁珠混合 1 h，然后用 1×PBST（含有 1% TritonX⁃100）洗涤磁珠3次，将 IP 样品用 2×Loading buffer 重悬，并 95℃煮沸 5 min，后续加入Anti⁃p⁃Ser、Anti⁃p⁃NLRC4、Anti⁃Myc、 Anti⁃Flag及相应二抗进行Western blot。

1.2.11 细胞免疫荧光

S.T（MOI：10）刺激后的 IBMDM，用 1×PBS 洗涤 3 次，4%多聚甲醛室温固定15 min，在0.02% NP⁃40 中通透 10 min，使用快速封闭液封闭 15 min，并用 Anti⁃ASC抗体（1∶100）孵育过夜。荧光标记的二抗 （FITC 标记的山羊抗鼠 IgG）室温避光孵育细胞 60 min，DAPI复染，通过荧光显微镜观察。同法处理过表达 TBK1 及 NLRC4 的 HEK293T 细胞，加入 Anti⁃Flag、Anti⁃Myc抗体（1∶100）及相应二抗孵育后，荧光显微镜观察。

1.2.12 ASC寡聚化实验

将 IBMDM 铺于细胞孔板中，待其密度达到 50%，使用S.T菌株（MOI：10）刺激细胞2 h，4℃ 裂解细胞30 min。收集细胞悬液，离心取上清备用。剩余细胞沉淀加入1×PBS重悬，加入DSS交联剂充分混匀，室温静置后离心，弃上清，加入Loading buffer 煮样。所有样品进行 Western blot 检测，加入一抗 Anti⁃ASC 及相应二抗孵育。通过化学发光试剂和化学发光成像系统获得图像。

1.2.13 S.T感染小鼠模型构建及相关炎症指标检测

将野生型（wild type，WT）C57BL/6 小鼠分为对照组与实验组，对照组用1×PBS灌胃预处理7 d，实验组用 25 mg/kg AML 灌胃预处理7 d，通过腹腔注射不同浓度的S.T 来感染小鼠以检测小鼠生存率及相关炎症指标等。

取对照组和实验组小鼠各5只，每只小鼠腹腔内注射1×10² CFU的S.T，观察和记录小鼠死亡时间。

取对照组和实验组小鼠各3只，每只小鼠在腹腔内注射1×10⁴ CFU的 S.T，感染24 h。依次收集小鼠的血清、腹腔灌洗液、肺脏。炎症因子检测：小鼠腹腔灌洗液在 4℃下 1 500 r/min 离心 10 min，收集上清，ELISA 试剂盒检测血清及腹腔灌洗液中的IL⁃1β 和TNF⁃α含量。细菌负荷量检测：将肺脏称重，并置于含有1 mL无菌 1×PBS 1.5 mL 离心管中利用组织研磨仪进行组织研磨（60 Hz，2~5 min）。按梯度稀释法稀释得到组织匀浆，取200 μL稀释后的混合液，涂板，将平板置于 37℃过夜，拍照、计数统计小鼠S. T感染后肺脏的细菌负荷量，同法统计腹腔灌洗液中的细菌负荷量。中性粒细胞比例检测：取小鼠腹腔灌洗液 4℃下 1 500 r/min 离心 10 min，收集细胞沉淀，向细胞沉淀加入 2 mL 红细胞裂解液重悬裂解 2 min，并加入 8 mL 1×PBS 终止裂解，并在 4℃ 1 500 r/min离心10 min，弃上清。用 200 μL 1×PBS 重悬，滤网过滤后，加入含有 APC⁃CD11b、PE⁃Ly6G抗体 （1∶400）的混合液重悬，冰上孵育 30 min。孵育结束后，在1.5 mL EP管中加入 200 μL 1×PBS漂洗抗体， 3 000 r/min 4℃离心 7 min，弃上清，使用400 μL 1× PBS重悬，流式细胞仪检测腹腔灌洗液中的中性粒细胞比例。

1.3 统计学方法

统计学分析及相关绘图通过 GraphPad Prism 7.0软件实现。所有实验数据以均数±标准差（$\stackrel{-}{x}\pm s$） 表示，两组间比较采用独立样本t检验，多组间比较采用单因素方差分析，Kaplan⁃Meier 方法分析小鼠死亡率。P <0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 TBK1参与调控NLRC4炎症小体激活

为了检测TBK1是否参与调控NLRC4炎症小体的活化，使用 TBK1 抑制剂（GSK8612）预处理小鼠 IBMDM细胞，在S.T刺激作用下，抑制TBK1可导致 Caspase⁃1和GSDMD剪切条带明显减少（图1A、B）； 在S.T感染的RAW264.7中，同样观察到，抑制TBK1 可以抑制 Caspase⁃1 和 GSDMD 的剪切（图1C、D）。使用制备的 NLRC4 特异性激动剂 S.T 鞭毛蛋白（FLIC）刺激 IBMDM 也显示相同的结果（图1E、F）。为了进一步确认TBK1对NLRC4炎症小体诱导的细胞焦亡的作用，分别检测在S.T或FLIC刺激下，IBM⁃ DM 和 RAW264.7 的细胞培养上清中的 LDH 含量，结果显示，抑制 TBK1 降低了 IBMDM 和 RAW264.7 细胞培养上清中 LDH 的含量（图1G、H、I）。在 RAW264.7 细胞中采用shRNA敲减TBK1，同样观察到敲减TBK1可以抑制Caspase⁃1和GSDMD的剪切 （图1J、K）以及LDH的释放（图1L）。以上数据表明，在巨噬细胞中，TBK1参与调控NLRC4炎症小体的活化。

2.2 TBK1与NLRC4相互作用

有研究报道NLR家族中的NLRP3与TBK1具有相互作用，而NLRC4与NLRP3具有高度相似的结构，同样包括NACHT与LRR结构域，所以推测NLRC4与 TBK1 可能也存在相互作用。在 HEK293T 细胞中过量表达 Flag⁃NLRC4、Myc⁃TBK1，Co⁃IP 结果表明 NLRC4 与 TBK1 具有相互作用（图2A、B）。为进一步确定二者是否有直接相互作用，使用纯化的HIS⁃ NLRC4以及GST⁃TBK1蛋白，进行GST pull⁃down实验，结果显示，NLRC4与TBK1具有直接的相互作用 （图2C、D）。并且，在HEK293T细胞中过量表达Flag⁃ TBK1、Myc⁃NLRC4，免疫荧光实验结果显示TBK1与 NLRC4在空间上共定位（图2E）。为了确定 TBK1 与 NLRC4 相互作用的具体结构域，构建了一系列 TBK1与 NLRC4 的截短体，并通过 Co⁃IP 实验证明了 TBK1 的 N端与NLRC4的 NACHT结构域存在相互作用（图2F、G）。并且发现影响TBK1的激酶永久活性形式（Ser172D）和永久非活性形式（Ser172A）都不会改变 TBK1 与 NLRC4 的相互作用（图2H），表明 TBK1 的激酶活性不影响其与 NLRC4 的相互作用。以上结果表明 TBK1 可以和 NLRC4 相互作用。

2.3 TBK1影响ASC寡聚物的形成

激活 NLRC4 炎症小体会诱导 ASC 在内的大分子复合物组装，活化的NLRC4与ASC结合并与ASC 斑点共定位。为了检验TBK1是否影响炎症小体组装，检测抑制TBK1对NLRC4炎症小体的ASC斑点形成的影响。实验结果显示，与 S.T 组相比，TBK1 抑制剂 GSK8612 处理组的 ASC 斑点明显减少（图3A），同时其ASC寡聚物也显著降低（图3B）。以上数据表明抑制 TBK1 可以减少 ASC 寡聚体形成，影响ASC⁃NLRC4复合体的组装。

2.4 TBK1磷酸化NLRC4 Ser533位点

已有研究表明，NLRC4的第533位丝氨酸的磷酸化对于NLRC4炎症小体的激活至关重要^[11]，因此本研究检测磷酸化酶 TBK1 能否磷酸化 NLRC4。在 HEK293T细胞中过量表达Flag⁃TBK1和Myc⁃NLRC4 或 Myc ⁃NLRC4（Ser533A）（NLRC4 的永久非磷酸化变体），通过免疫沉淀收集 Myc⁃NLRC4 或 Myc⁃ NLRC4（Ser533A），采用Anti⁃p⁃NLRC4（Ser533）磷酸化抗体检测，结果显示，TBK1 促进 Myc⁃NLRC4 的 Ser533 磷酸化，而阴性对照 Myc⁃NLRC（4 Ser533A） 无信号（图4A）。而且，在HEK293T细胞中分别过量表达 Myc ⁃ NLRC4、Myc ⁃ NLRC4（Ser533A）、Myc ⁃ NLRC4（Ser533D）（NLRC4 的永久磷酸化变体）和 Flag⁃TBK1，免疫共沉淀和 Western blot 检测表明， NLRC4 Ser533位点的磷酸化并不影响其与TBK1的相互作用（图4B）。以上结果说明，TBK1可以磷酸化 NLRC4 Ser533位点。

2.5 抑制TBK1可提高小鼠防御S.T感染能力

ELISA结果显示，与对照组相比，实验组小鼠的血清及腹腔灌洗液中的IL⁃1β和TNF⁃α含量减少（图5A~D），细菌负荷量也明显降低（图5E、F），差异有统计学意义。流式细胞术结果也同样显示实验组小鼠腹腔灌洗液中的中性粒细胞（CD11b⁺ /Ly6G⁺）比例下降（图5G、H），实验组小鼠的生存率显著提高（图5I），差异有统计学意义。以上结果说明抑制TBK1可以通过控制NLRC4炎症小体的过度活化，稳定免疫微环境，提高小鼠防御S.T感染的能力。

3 讨论

NLRC4 炎症小体在防御胞内菌感染过程中发挥了重要作用，当宿主细胞受到胞内菌（如S.T）感染时，S.T通过其T3SS分泌系统将毒力蛋白分泌到胞内，随后被胞内受体 NAIP 识别并结合，激活后的 NAIP与 NLRC4 结合并解除其自身抑制结构，从而招募ASC等蛋白组装形成炎症小体。激活Caspase⁃1，促进IL⁃1β和IL⁃18的成熟，切割GSDMD，诱导细胞焦亡。然而，对于NLRC4炎症小体的具体调控机制仍然不清。

NLRC4 炎症小体激活的调节机制是近来研究的热点。本研究发现TBK1与NLRC4相互作用，抑制TBK1的活性可以下调S.T诱导的NLRC4炎症小体活化。TBK1作为重要的炎症调节激酶参与多种炎症通路的调节^[9-10]，本研究发现TBK1对NLRC4炎症小体的调节作用，为多种信号通路与炎症小体通路的交叉调节提供了新线索。NLRC4 Ser533 位磷酸化作为NLRC4炎症小体调节的重要环节，已发现蛋白激酶C⁃δ（protein kinase C⁃δ，PKC⁃δ）对其的磷酸化作用^[3]，而本研究发现TBK1可以作为NLRC4的磷酸化酶对其活性进行调节，丰富了该位点调节的多样性，符合炎症调节网络化的特性。炎症小体的过度激活会导致炎症因子风暴，最终引起脓毒症^[16-17]。在S.T 感染小鼠模型中，本研究发现TBK1抑制剂AML处理的小鼠腹腔灌洗液及肺脏中的细菌负荷量显著减少，血清及腹腔灌洗液中的 IL⁃1β和 TNF⁃α含量降低，腹腔灌洗液的中性粒细胞比例也同样下降，小鼠生存率显著提高，其关键在于 AML 抑制了 NLRC4 炎症小体的过度激活，稳定了免疫微环境。值得注意的是，本研究虽然证明了 TBK1 和 NLRC4 存在相互作用，TBK1 的活性是调节 NLRC4 炎症小体的关键，但是并不能排除 TBK1 通过相互作用间接影响了 PKC⁃δ或其他磷酸化酶对 NLRC4 的533位丝氨酸磷酸化修饰的可能性，并存在多种激酶共同影响 NLRC4 磷酸化的可能，其具体机制还有待深入研究。

综上所述，本研究发现TBK1通过与NLRC4相互作用，磷酸化NLRC4 Ser533位点，促进NLRC4炎症小体激活，提出了TBK1精细调控NLRC4炎症小体抵御胞内细菌感染的新机制。

参考文献