热性惊厥（febrile seizure，FS）多发于儿童，是一种体温突然升高并伴随癫痫发作的神经性疾病^[1]，复发风险较高。研究表明，第1次惊厥发作时年龄不满12个月的婴幼儿，在随后1年内有高达50%的概率再次出现惊厥发作^[2]，而反复持续发作的惊厥会损伤海马功能，影响记忆和学习，甚至会增加成年后癫痫发作和其他神经性疾病发作的风险^[3]。目前 FS的病理生理学机制尚不确切，现代研究观点多认为该疾病与遗传、神经炎症和免疫等因素有关。

地西泮、苯巴比妥、丙戊酸钠（sodium valproate/ valproic acid，VPA）等药物常用于临床的抗惊厥治疗^[4]，但对于婴幼儿来说，该类药物的潜在不良反应，如短暂性共济失调、呼吸抑制、心动过缓以及低血压等导致的危害甚至远超疾病本身，因此并不适合婴幼儿惊厥的预防和长期使用^[5]。中医重视整体观念，讲究辨证治疗，在疾病防治和新药开发中具有独特优势，其中动物胆汁和动物胆汁类药物应用于惊厥治疗在我国拥有久远历史。动物胆汁包括猪胆粉、牛胆粉、蛇胆粉和熊胆粉等，胆汁类药物如胆南星、化风丹、牛黄等^[6-7]，它们均被证明具有镇静、抗炎、抗惊厥等多种治疗作用，但其中何种活性物质发挥镇静抗惊厥作用暂不明确。动物胆汁相关的药物中多以胆汁酸类成分为主，胆酸（cholic acid， CA）和去氧胆酸（deoxycholic acid，DCA）含量丰富，是其主要的胆汁酸类成分，同时两者也是机体产生的内源性次级胆汁酸代谢成分，因此推测 CA 和 DCA 可能是动物胆汁类传统药物发挥抗惊厥作用的活性物质之一，而CA和DCA在结构上仅7α位相差一个羟基，因此探究两者在惊厥治疗方面可能存在的活性及差异性是有必要的。目前对于胆酸类化合物抗惊厥作用的研究甚少，其抗惊厥药效不清楚，作用机制不明。因此本研究通过胆汁酸单体化合物CA和DCA预给药惊厥大鼠，探索CA和DCA对反复性热水浴刺激导致的惊厥大鼠的药理作用，并利用血清代谢组学方法探究CA和DCA的抗惊厥作用机制，旨在为开发新的抗惊厥药物提供研究思路和理论依据。

1 材料和方法

1.1 材料

1.1.1 仪器

ME104/02 型电子分析天平（梅特勒⁃托利多仪器上海有限公司）；JY92⁃IIN型高速冷冻离心机（湖南湘仪离心机仪器有限公司）；冻干机（东京理化器械株式会社，日本）；SCIENTZ⁃48L型高通量组织研磨器（宁波新芝生物科技有限公司）；Epoch 2型酶标仪（BioTek公司，美国）；倒置光学显微镜（奥林巴斯公司，日本）；超高效液相色谱仪 Dionex Ultimate3000（Thermo Fisher 公司，美国）；静电场轨道阱高分辨质谱仪（Thermo Fisher 公司，美国）；Waters ACQUITY UPLC C18 柱 2.1 mm × 100 mm，1.7 μm （Waters公司，美国）；台式高速冷冻离心机H1750R （湖南湘仪公司）。

1.1.2 试剂

羧甲基纤维素钠购自麦克林公司（J1204A）； VPA购自上海源叶生物科技有限公司（S60377）；CA 和DCA购自美仑生物公司（O1025A，J0102A），肿瘤坏死因子α（tumor necrosis factor α，TNF⁃α）、白介素 6（interleukin 6，IL⁃6）、IL⁃1β检测试剂盒均购自睿信生物科技有限公司（RX302058R、RX302856R、 RX302869R）；大鼠谷氨酸（glutamate，Glu）和γ⁃氨基丁酸（γ⁃aminobutyric acid，GABA）检测试剂盒购自江苏酶免生物科技有限公司（MM⁃0601R1、MM⁃0441R1）。

1.1.3 动物

3周龄的雄性SD大鼠，体重约（50±5）g，购自广东省医学实验动物中心，经检验合格后饲养于SPF 级实验室，室温22~24℃，湿度60%，12 h明暗交替，自由饮食饮水。本研究获得广东药科大学动物保护伦理委员会的批准（动物伦理编号：D202402⁃8）。

1.2 方法

1.2.1 动物分组与模型建立

SD大鼠经过适应性喂养后随机分为对照组、模型组、VPA组（189 mg/kg）、CA组（60 mg/kg）、DCA组 （60 mg/kg），各给药组均以0.5%羧甲基纤维素钠为溶剂，每组9只。VPA、CA 和DCA剂量参照国内外研究^[8-11]。

除对照组外，各组大鼠均置于装有（45.0±0.5）℃ 热水的容器中进行造模，水位以大鼠在水中站立刚好露出头部为宜。根据不同分组分别进行造模和给药，每2 d热水浴1次，在连续8次热水浴后，根据各组惊厥表现、各项指标及文献报道情况，综合考察造模情况，造模方法参照文献^[12-13]。大鼠在造模 5 min 后或惊厥发作后立即离水，由两位观察人员记录大鼠惊厥行为学情况，并根据拉辛量表^[14] （表1）对大鼠惊厥发作行为的严重程度进行评分。每次造模前1 h灌胃给药，次日不造模亦正常给药，对照组及模型组为假给药，给予等剂量的溶剂，于末次造模3 h后取材。

1.2.2 大鼠惊厥行为学观察

每次造模时均由两位观察人员负责记录各组大鼠的惊厥发作时间、惊厥结束时间、惊厥发作等级，并计算惊厥持续时间。当大鼠出现不自主仰头动作或肢体抽动时便视为惊厥发作，大鼠从进入水中开始到惊厥发作的时间即为惊厥潜伏期。大鼠最后一次身体抽搐停止的时间即为惊厥结束时间。从大鼠惊厥发作到惊厥结束的时长便为惊厥持续时间。

1.2.3 大鼠血清及海马组织中TNF⁃α、IL⁃6和IL⁃1β 含量检测

将大鼠麻醉后，腹主动脉取血。室温下静置1 h， 4℃，3 000 r/min 离心 15 min，吸取上清按照 ELISA 试剂盒说明书进行检测。

将大鼠处死后，在冰上快速分离出海马组织，按照1∶9的重量体积比，将海马组织称重后加入对应体积预冷的生理盐水，加入磁珠，在组织匀浆机中3 000 r/min匀浆20 s，3次。最后在高速离心机中 4℃ 12 000 r/min 离心 30 min，吸取上清按照 ELISA 试剂盒说明书进行检测。

1.2.4 大鼠海马组织中Glu和GABA含量检测

于-80℃冰箱取出分装的海马组织，按照 1∶9 的重量体积比，加入对应体积预冷的生理盐水，以 3 000 r/min 20 s，进行3次组织匀浆，4℃ 12 000 r/min 离心 30 min 后，吸取海马组织上清液按照 Glu 和 GABA试剂盒说明书进行测定。

1.2.5 苏木精⁃伊红（hematoxylin⁃eosin，HE）染色观察海马神经元病理损伤

大鼠处死后，断头取脑组织，放入4%多聚甲醛中固定24 h，梯度酒精脱水，浸蜡，石蜡包埋后切成厚4 μm的薄片，HE染色，脱水，使用中性树胶封片，在光学显微镜下观察海马组织 CA1 和 CA3 神经元病理形态变化。

1.2.6 血清代谢组学分析

1.2.6.1 样品前处理

取出冻存的大鼠血清60 μL，加入600 μL质谱级纯甲醇涡旋混匀，4℃ 15 000 r/min 离心 10 min。取上清液在50℃ 1 700 r/min，真空度为10的条件下离心浓缩。待溶剂挥干后，加入100 μL的50%甲醇复溶涡旋混匀，随后4℃ 15 000 r/min离心10 min。各样品管中取60 μL上清液于质谱进样瓶中，用于上样检测。再在各样品中分别吸取20 μL上清液于 4℃ 15 000 r/min 离心 10 min，取 100 μL 上清液用作质量控制（quality control，QC）。取100 μL的50% 甲醇于进样瓶中，作为空白溶剂。

1.2.6.2 超高效液相色谱仪串联高分辨质谱检测条件

将各样品随机排序上机检测，每10个样品中插入1个QC样品用于质控分析。

色谱条件：柱温 40℃，样品盘温度 10℃，进样体积：2 μL，流速：0.4 mL/min，流动相A相：0.1%甲酸水溶液，B相：乙腈，梯度洗脱（0~6.0 min：95%A→30% A；6.0~11.0 min：30%A→0%A；11.0~14.0 min：0%A； 14.0~14.1 min：0→95%A；14.1~17.0 min：95%A）。

质谱条件：使用赛默飞旗下三合一Orbitrap Fusion 进行质谱检测，负离子模式，离子传输管温度为300℃； 电压为2 800 V；蒸发温度为320℃；鞘气20 Arb；反吹气 8 Arb；检测分辨率为 30 000；质荷比范围为 120~1200 m/z。

1.2.6.3 数据处理分析

借助Orbitrap Fusion Tune3.0进行数据采集，使用 X calibur 4.1 调取总离子流图。使用 Compound Discoverer 3.3进行峰和保留时间的识别、提取、校正以及归一化处理。借助 Mass Fronier 8.0 推测峰二级碎裂结构，使用 MetaboAnalyst 进行主成分分析 （principal component analysis，PCA），正交偏最小二乘法判别分析（orthogonal partial least squares ⁃ dis⁃ criminant analysis，OPLS⁃DA）。借助HMDB代谢数据库将化合物名称转换为HMDB ID后，在MetaboAna⁃ lyst 网站通过 KEGG（Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes）数据库进行通路富集和通路分析。

1.3 统计学方法

采用 GraphPad Prism 8.00 软件对实验数据进行统计分析，实验结果采用单因素方差分析比较不同组间差异，对于两组以上的比较，则采用Tukey’s 分析进行事后检验。P <0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 大鼠惊厥行为学观察

模型惊厥表现：当热水浴开始时，大鼠表现为四处探索，因水温不适而出现跳跃等动作。大约2 min 后，因体力消耗，大鼠挣扎频率变慢，跳跃幅度变小。随后出现失神发作，间歇性仰头，在水中静止，偶尔下沉。惊厥发生时大鼠先是出现肢体轻微抽动，而后多肢抽动甚至全身抽搐，多次发作。有时身体因剧烈抽搐而呈现反弓状，甚至从桌面弹起，全身强直。停止抽搐后大鼠处于失神状态，四肢无力。约 3~5 min 后恢复意识，表现为抬头，主动探索，舔毛，恢复自主爬行。

与模型组惊厥表现相比，VPA 和 CA 以及 DCA 组均显著延长大鼠的惊厥潜伏期、缩短惊厥持续时间，表现出良好的治疗作用（P 均 <0.001，图1A、 B）。与模型组相比，VPA组和DCA组大鼠惊厥发作的严重程度显著降低（P <0.001和P <0.01），CA也能降低惊厥大鼠发作的严重程度，但能力稍弱（P <0.05，图1C）。

2.2 大鼠血清及海马组织中TNF⁃α、IL⁃6和IL⁃1β含量分析

图2 所示，与对照组相比，模型组大鼠血清中 TNF⁃α、IL⁃6 和 IL⁃1β水平显著升高（P 均 <0.001）。经药物干预后，各组血清炎症因子均有不同程度的降低。DCA 的作用效果与 VPA 较为相近，而 CA 组的 1L ⁃1β表达与模型组比无显著性差异（P >0.05）。

如图3 所示，与对照组相比，模型组大鼠海马组织中的 TNF⁃α、IL⁃6 和 IL⁃1β水平显著升高（P 均 <0.001）。而与模型组相比，各给药组大鼠的炎症因子水平均有不同程度的降低。VPA 组和DCA 组大鼠TNF⁃α、IL⁃6和IL⁃1β水平显著降低，两组效果相近。CA显著降低海马组织中TNF⁃α和IL⁃1β含量 （P <0.001），而CA组的IL⁃6水平与模型组比差异无统计学意义（P >0.05）。

2.3 大鼠海马组织中Glu和GABA含量分析

如图4所示，与对照组相比，模型组大鼠海马组织中神经递质Glu的含量显著升高（P <0.001），GABA 含量显著降低（P <0.001），表明惊厥对大鼠海马组织造成损伤，而各给药组惊厥大鼠海马组织中 Glu 含量均显著降低（P均 <0.001），惊厥大鼠的GABA 含量显著回升（P 均 <0.001），表明各组给药后，惊厥导致的海马组织功能损伤得到一定恢复。

2.4 HE染色观察

如图5所示，对照组大鼠海马区的锥体细胞（红色箭头）形态规则，排列整齐密集，胞核大而圆，呈均匀淡蓝色，核仁清楚，细胞质丰富，层次及细胞界限清晰。而模型组大鼠海马组织中锥体细胞胞体紧缩，体积变小，染色加深，嗜碱性增强，胞质胞核分界不清（黑色箭头）。与模型组相比，各给药组大鼠海马神经元细胞形态得到明显改善。虽偶有细胞空泡变性，核固缩，但可观察到锥体细胞数目明显增多，排列相对整齐，细胞形态基本正常。DCA 组大鼠海马神经元细胞形态与VPA组相近。

2.5 血清代谢组学分析

使用 Orbitrap Fusion Tune3.0 进行各样本质谱数据的采集后，再通过 Xcalibur 4.1 调取出各组样品的总离子流图，图6 为对照组、模型组、CA 组和 DCA 组血清样品的总离子流图。随后将数据导入 Compound Discoverer 3.3软件进行数据处理，经过峰提取、过滤、降噪和归一化校正数值基线等处理后，共获得1 081个色谱峰。通过与文献、ChemSpider、 mzcloud和mzvault等数据库和相关标准品化合物的碎裂谱图进行比对后，共鉴定出312个化合物。化合物种类主要包括氨基酸、多肽和类似物；脂肪酸和偶联物，胆汁酸类、芳醇酸及其衍生物类；以及有机磺酸类、酮酸类、吲哚、苯及其衍生物类。

2.5.1 PCA和OPLS⁃DA分析

对照组、模型组与各给药组及 QC 之间的 PCA 图显示，QC分布集中，表明仪器稳定性良好，检测系统可靠。对照组和模型组数据分布较为离散，提示长期惊厥对大鼠的代谢造成了一定的影响。模型组与各给药组之间数据较为离散，表明惊厥大鼠在给药后，血清代谢发生明显改变（图7）。

OPLS⁃DA 分析显示，对照组与模型组，模型组与 CA 组、DCA 组分布无交叉，分离效果好，对照组与模型组：R2X=0.489，R2Y=0.911，Q2=0.840，模型组与CA组：R2X=0.340，R2Y=0.785，Q2=0.638；模型组与DCA组：R2X=0.365，R2Y=0.903，Q2=0.839。各组Q2均>0.5，表明模型稳定性良好，具有较好的预测能力（图8）。

2.5.2 差异代谢物筛选结果

对照组与模型组血清差异代谢物分析比较共获得35个差异表达的化合物，其中模型组中有30个化合物含量升高，5个化合物含量降低（图9）。经给药后，共有13个化合物受到显著调节，其中CA组显著下调模型组中升高的11个化合物，DCA组显著下调模型组中升高的10个化合物，上调模型组中降低的 1个化合物，两者共有差异代谢物9个。差异代谢物在各组的相对含量见表2。

2.5.3 KEGG代谢通路富集分析

将模型组与各给药组的差异代谢物数据导入 MetaboAnalyst 分析平台中进行代谢通路富集分析。如图10所示，CA和DCA的抗惊厥作用与调节柠檬酸循环、氨基酸代谢和丁酸代谢通路有关。氨基酸代谢主要包括丙氨酸、天冬氨酸和谷氨酸代谢，精氨酸生物合成，D⁃谷氨酰胺和D⁃谷氨酸代谢。

Compared with the control group，^##P <0.05，^##P <0.01，^###P <0.001；compared with the model group，^* P <0.05，^**P <0.01，^***P <0.001（n=6）.

3 讨论

热性惊厥是由体温突然身高而导致的癫痫抽搐，现代病理研究表明，惊厥与炎性递质的释放和脑内神经递质的稳定性密切相关。VPA 作为抗惊厥癫痫药物广泛应用，对于惊厥和癫痫等神经系统疾病具有明显的抑制作用，能抑制脑内GABA的降解，增加其合成，进而控制脑部的异常放电，从而缓解惊厥癫痫的发作，但其使用剂量需严格控制，常规的治疗剂量即可能导致诸多不良反应^[15]，如胃肠道刺激、神经功能紊乱和肝损伤等。

本研究结合大鼠惊厥行为学、血清和海马组织生化指标以及HE染色切片等表明，CA和DCA均有不同程度的抗惊厥作用，能显著降低血清和海马组织中炎症递质的释放，保护炎症释放导致的海马神经元损伤，调节脑内的Glu和GABA的平衡，进而抑制脑内异常放电，缓解惊厥的损伤及发作。并且 DCA 的抗惊厥作用更好，效果甚至同 VPA 趋于一致。CA 和 DCA 作为人体的内源性胆汁酸成分，在体内由肝脏合成并代谢，正常人每天通过肝肠循环维持体内的胆汁酸平衡，多余胆汁酸则会通过粪便排泄出体外^[16]。也有研究报道胆汁酸类成分在体内的作用时间持久，与蛋白之间的结合率高，且高浓度时导致的不良反应发生率较低^[17]，因此与VPA 相比，胆酸类药物在安全性方面具有更大的优势。

作为生物合成和分解代谢途径的终产物和副产物，代谢物分子一直在参与机体的生理和病理过程。通过对代谢物进行分析，可推测机体各器官和组织正在发生的生理变化^[18]。由于代谢组学固有的敏感性，可以检测到生物途径的微妙变化，有助于深入了解各种生理病理过程背后的机制^[19]。通过代谢组学分析发现，模型组惊厥大鼠血清中牛磺酸、α⁃酮戊二酸、脱氢抗坏血酸等35个化合物的含量与对照组大鼠存在显著差异，通路分析发现，异常的牛磺酸代谢、氨基酸代谢和能量代谢似乎是惊厥病理状态下的特殊的生化特征。而CA和DCA能显著调节惊厥大鼠异常的能量代谢、氨基酸代谢和丁酸代谢。

葡萄糖能通过糖酵解、三羧酸循环（tricarboxylic acid cycle，TCA）和氧化磷酸化等过程产生三磷酸腺苷为机体供能。大脑虽仅占体重的 2%，但它对葡萄糖的利用却占到人体葡萄糖总利用率的25%^[20]，通过对多种精神疾病的发病机制研究后发现，这些患者表现为葡萄糖的代谢利用率低，其能量代谢功能障碍，表明了能量代谢功能障碍与多种精神疾病发病可能存在的关联性^[20]。研究发现精神分裂症和双相情感障碍患者葡萄糖代谢减少，TCA循环酶活性降低，氧化磷酸化受损^[21-22]。同样地，本研究通过对差异代谢物进行通路富集分析发现，模型组大鼠的柠檬酸循环、苹果酸⁃天冬氨酸穿梭、糖异生作用、葡萄糖⁃丙氨酸循环等产能代谢水平下调，由此推测惊厥发生可能与机体的能量代谢功能障碍有关。在CA和DCA的干预下，各组大鼠的能量代谢水平显著恢复，提示胆酸和去氧胆酸的抗惊厥作用与调节机体的能量代谢有关。

氨基酸是维持机体代谢和生长发育所必需的有机化合物，还可作为细胞信号分子调节基因表达^[23]，研究发现氨基酸代谢障碍似乎与多种精神疾病的发病有关^[20]。在神经系统中，内源性兴奋性氨基酸如Glu和丝氨酸作为神经递质履行突触可塑性作用^[24]。天冬氨酸是已知的谷氨酸脱羧酶抑制剂，它的还原可以促进抑制性神经递质 GABA 的合成。此外，在精神疾病患者中常观察到丙氨酸、精氨酸、色氨酸、脯氨酸等氨基酸血清和血浆浓度的改变^[25]。本研究也观察到模型组大鼠血清中多种氨基酸代谢出现异常，且在药物干预后其水平明显恢复。这说明异常的氨基酸代谢是惊厥的病理表现之一，CA 和 DCA 的抗惊厥作用与调节氨基酸代谢有关。

丁酸是由肠道菌群产生的一种短链脂肪酸，具有重要的代谢调控功能，可通过刺激胰高血糖素样肽⁃1 等肠道激素的产生参与体内糖脂代谢的调控^[26]，还可通过激活G蛋白偶联受体参与神经递质的产生和神经保护^[27-28]。本研究发现惊厥大鼠的丁酸代谢下调，经CA和DCA治疗后，丁酸代谢水平显著恢复，提示丁酸等短链脂肪酸在惊厥的发生和发展中具有重要作用。

综上所述，胆汁酸单体成分 CA 和 DCA 均能从多个方面发挥抗惊厥作用，CA 和 DCA 的抗惊厥作用与柠檬酸循环、氨基酸代谢和丁酸代谢通路的调节有关。在抗惊厥药效方面，CA 和 DCA 都具有药效活性，但DCA的抗惊厥作用更强，而CA和DCA作为胆汁代谢的次级代谢产物，是机体内产生的内源性胆汁酸成分，同肝、脑、肠等多系统具有密切的内在联系。本次研究仅对两个次级胆汁酸成分进行在抗惊厥方面研究，对开发抗惊厥药物有一定的参考意义，但仍需进一步深入研究验证，为探寻惊厥发作机制，多系统内在联系以及抗惊厥药物的开发提供更多的证据。

参考文献