随着年龄的增长，女性生育能力逐渐减退，表现为卵母细胞数量和质量的逐渐下降^[1]。提供细胞能量的线粒体功能低下是卵母细胞衰老的一个重要机制，而近年来的研究提出了内质网⁃线粒体轴的概念。内质网和线粒体密切接触的部位称为线粒体相关内质网膜（mitochondria⁃associated endoplasmic reticulum membrane，MAM），参与脂质合成和运输、钙（Calium ion，Ca²⁺）稳态、活性氧（reactive oxygen species，ROS）产生、线粒体自噬和内质网应激等过程，在细胞的生理和病理活动中起重要作用^[2]。Ca²⁺ 作为第二信使，是 MAM 界面传递的重要信息物质^[3]。 MAM 间 Ca²⁺ 传输紊乱已被证实与衰老相关疾病如神经退行性病变^[4]、糖尿病相关病变^[5]、癌症等有关，并造成肥胖小鼠卵母细胞质量下降^[6]，但其在衰老卵母细胞中的作用尚未见报道。

腐胺是能量代谢三羧酸循环中的一种多胺，由鸟氨酸在鸟氨酸脱羧酶的作用下生成，在抗氧化、抗凋亡和抗炎中发挥重要的作用^[7]。研究发现，高龄小鼠排卵期鸟氨酸脱羧酶活性降低，腐胺生成减少。在卵母细胞体外成熟（in vitro maturation， IVM）培养液中或小鼠排卵期的饮用水中补充腐胺，可以降低卵母细胞非整倍体率和胚胎丢失率，提高高龄小鼠的生育能力^[8]。推测腐胺可以通过上调丙酮酸脱氢酶激酶 4 表达和提高线粒体活性来延缓卵母细胞的衰老过程^[9]。然而，腐胺对 MAM 能否起到调控作用，从而改善卵母细胞质量的研究尚未见报道。本研究使用自然衰老小鼠作为研究模型，以卵母细胞中 MAM 为观察指标，在 IVM 培养液中添加腐胺，观察其对衰老卵母细胞的改善作用。

1 材料和方法

1.1 材料

孕马血清促性腺激素（PMSG，宁波第二激素厂）；腐胺（putrescine，Put，Sigma 公司，美国）；IVM液、TYH 液、HTF 液、KSOM 液、M2 培养液、透明质酸酶（南京爱贝生物有限公司）；4%多聚甲醛固定液（上海碧云天公司）；Triton X ⁃100（BioFroxx 公司，德国）；PBS 缓冲液（上海塞维尔公司）；DAPI⁃ Fluoromount⁃G 抗荧光淬灭封片剂（SouthernBiotech 公司，美国）；聚乙烯醇（上海碧云天公司）；LCA⁃ FITC（Invitrogen 公司，美国）；Anti ⁃α⁃Tubulin 抗体 （Abcam公司，美国）；戊二醛固定液（北京百瑞极公司）；Fluo⁃4 AM（Invitrogen公司，美国）；Rhod⁃2 AM、 Mag⁃Fluo⁃4 AM（上海懋康生物公司）；ROS检测试剂盒、增强型线粒体膜电位检测试剂盒、增强型 ATP 检测试剂盒（上海碧云天公司）；Micro RNA Kit （QIAGEN 公司，德国）；ChamQ SYBR qPCR Master Mix（南京诺维赞公司）。

1.2 方法

1.2.1 动物及分组

实验采用 C57/B6J 小鼠，选择 8 周龄小鼠作为年轻组，40周龄小鼠作为老龄组。动物实验方案由南京医科大学动物伦理委员会批准（实验伦理号： IACUC⁃2208018），所有小鼠均购于南京医科大学实验动物基地生产部。小鼠在 22℃下保持 12 h/12 h 的暗⁃光循环，自由进食饮水。

1.2.2 生发泡（geminal vesical，GV）期卵母细胞获取和IVM

以10 U/只小鼠的标准注射PMSG，46~48 h后取 GV期卵丘⁃卵母细胞复合体（cumulus⁃oocyte complex， COC）。其中，8周龄小鼠COC记为年轻组（Young）， 40 周龄小鼠 COC 记为高龄组（Old），IVM 液中添加 0.5 mmol/L 腐胺的高龄组 COC 记为腐胺组（Put）。其中IVM液中腐胺添加浓度的标准参考Liu等^[10] 研究。在37℃、5%CO₂培养箱中培养14~16 h，然后使用透明质酸酶脱去卵丘颗粒细胞，在显微镜下观察卵母细胞第一极体排出情况。收集MⅡ期卵母细胞用于后续实验。实验至少重复3次，每次每组使用 20~30个COC。

1.2.3 体外胚胎培养

处死C57/B6J雄鼠，取附睾并划开输精管，使精子进入 TYH 液中获能 60 min。将 COC 在 HTF 液中清洗3次后置于新的液滴中，加入已获能精子共培养4~6 h。在KSOM培养液中清洗卵母细胞并在新鲜的液滴中继续培养，在胚胎发育至二细胞期（受精后24~30 h）和囊胚期（受精后96~100 h）进行拍照观察。以上培养均在37℃、5% CO₂培养箱中完成，实验至少重复3次，每次每组使用20~30个COC。

1.2.4 卵母细胞免疫荧光

MⅡ期卵母细胞脱颗粒后在1% HCl中脱除透明带，并清洗3次。随后在4% PFA中室温固定30 min， PBS 清洗 3 次后移入 0.5% Triton×100 中室温破膜 20 min。PBS 清洗 3 次后使用封闭液室温封闭 1 h。将卵母细胞移入相应的一抗中 4℃过夜，PBS 清洗 3次后避光室温孵育二抗1 h。PBS清洗3次后使用 DAPI染细胞核，封片。共聚焦显微镜下进行拍照观察，使用Image J软件进行共定位及半定量分析。实验至少重复3次，每次每组使用15枚卵母细胞。

1.2.5 透射电镜拍摄

每组收集至少 20 枚 MⅡ期卵母细胞，首先在 2.5%戊二醛中室温固定2 h，然后使用伊红染色，包裹于 1.5%琼脂糖中并离心，使卵母细胞聚集于 EP 管底。待琼脂糖凝固后再加入戊二醛固定，冰上送至南京医科大学分析测试中心进行下一步制样及切片工作。最后使用JEM⁃1400Flash透射电子显微镜观察。

1.2.6 Ca²⁺ 水平测定

分别使用 Fluo⁃4 AM、Rhod⁃2 AM 和 Mag⁃Fluo⁃ 4AM测定MⅡ期卵母细胞质、线粒体和内质网Ca²⁺ 水平。按照说明书推荐浓度配制染色工作液。将卵母细胞在染色工作液中孵育30 min，使用M2培养液清洗3次后再次在新鲜的M2培养液中孵育30 min，以促进完全去酯化。孵育均在37℃，5%CO₂培养箱中完成，使用 Nikon Eclipse Ti 共聚焦显微镜拍摄。每种指标每组使用15枚卵母细胞进行染色，实验至少重复3次。

1.2.7 ROS和线粒体膜电位测定

分别使用 DCFH⁃DA 和 JC⁃1 检测 MⅡ期卵母细胞 ROS 和线粒体膜电位水平。将卵母细胞分别与 DCFH⁃DA 和 JC⁃1 在 37℃、5% CO₂培养箱中孵育 30 min，然后使用M2培养液清洗3次后置于共聚焦皿中。使用Nikon Eclipse Ti共聚焦显微镜检测荧光强度。每种指标每组使用10~15枚卵母细胞，实验至少重复3次。

1.2.8 ATP水平测定

使用增强型 ATP 检测试剂盒测量卵母细胞 ATP含量。每组使用20枚MⅡ期卵母细胞，在PBS 中清洗 3 次后移至 10 μL 裂解液中，使每组液体总量为 20 μL。根据说明书配制标准液。将 ATP 检测试剂和 ATP 检测试剂稀释液按 1∶4 的比例配制成ATP检测工作液。每个EP管内加入100 μL ATP 检测工作液，室温静置3~5 min，消除本底ATP。每个检测管内加入 20 μL 标准品或样品混匀，使用 GloMax 20/20 发光检测仪测定相对荧光亮度单位 （relative luminescence unit，RLU）值，并计算每个样本的ATP浓度。

1.2.9 RNA提取及qPCR

使用QIAGEN Micro RNA Kit提取MⅡ期卵母细胞总 RNA，随后加入逆转录试剂将 RNA 逆转录为 cDNA。各组基因表达通过实时荧光定量PCR仪进行扩增检测，条件为95℃预变性5 min、PCR反应为 95℃ 15 s、65℃ 1 min共40个循环，熔解曲线为65~95℃，每隔0.5℃进行信号检测绘制。各组基因表达差异采用2^-ΔΔCT相对定量法进行分析，引物序列见表1。

IP3R：the inositol1，4，5⁃trisphosphate receptor；GRP75：G protein⁃coupled receptor 75；VDAC1：voltage dependent anion channel1.

1.3 统计学方法

所有数据均以均数±标准差（$\stackrel{-}{x}\pm s$）表示，两组资料间比较采用独立样本t检验，多组资料间比较采用单因素方差分析，所有统计学结果均采用GraphPad Prism 8进行分析，P <0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 腐胺促进高龄小鼠卵母细胞成熟

观察各组小鼠卵母细胞体外培养和体外受精情况（图1A）。与年轻组比较，高龄组小鼠卵母细胞第一极体排出率显著下降，添加腐胺后显著升高（P <0.05，图1B）。高龄小鼠卵母细胞受精后二细胞率有下降趋势，但无显著性差异（图1C）。高龄小鼠卵母细胞囊胚率显著下降，而腐胺组囊胚率显著提高 （P <0.05，图1D），提示IVM培养液中添加腐胺能够促进高龄小鼠卵母细胞核成熟和胚胎发育。

2.2 腐胺改善高龄小鼠卵母细胞皮质颗粒的分布

使用 LCA⁃FITC 染色评估 MⅡ期卵母细胞皮质颗粒（cortical granule，CG）的分布（图2A）。在年轻组MⅡ期卵母细胞中，除了染色体附近无CG结构域外，CG均匀分布在卵母细胞皮质下区域。但在高龄组MⅡ期卵母细胞中，CG失去正常定位（P <0.001），且荧光信号强度显著减弱（P <0.001）。补充腐胺可显著挽救 CG 的错误定位（P <0.01），提高 CG 的荧光信号强度（P <0.05，图2B~C）。这表明腐胺可促进高龄卵母细胞胞质成熟。

2.3 腐胺改善高龄 MⅡ期卵母细胞纺锤体组装和染色体排列

通过免疫荧光染色图像评估发现，MⅡ期的高龄卵母细胞中存在染色体错位和纺锤体结构紊乱 （图3A）。与年轻卵母细胞相比，高龄卵母细胞MⅡ 期纺锤体异常率（P <0.001，图3B）和染色体异常率 （P <0.01，图3C）显著提高，但在补充腐胺后均显著下降（P <0.05，图3A~C）。这些结果表明腐胺可通过保持正确的纺锤体和染色体结构提高高龄小鼠卵母细胞的成熟能力。

2.4 腐胺降低高龄小鼠卵母细胞MAM水平

在透射电子显微镜下观察各组小鼠MⅡ期卵母细胞内的MAM（图4A），通常以MAM中内质网和线粒体间距、邻近内质网的线粒体长度与其周长的比值两个指标衡量MAM的数量及状态。统计分析发现，高龄小鼠 MⅡ期卵母细胞内 MAM 间距显著缩短，而腐胺组MAM间距显著增加（P <0.001，图4B）。 3 组间卵母细胞的线粒体中组成 MAM 部分长度与其周长的差异无统计意义（图4C），可能与高龄小鼠卵母细胞内线粒体肿胀变形，周长增加相关（P <0.01，图4D）。这些结果表明腐胺可使高龄卵母细胞内线粒体和内质网间距离增加，并因此降低其 MAM 水平。

2.5 腐胺降低高龄MⅡ期卵母细胞MAM间Ca²⁺ 传递关键分子的表达

三磷酸肌醇受体（75⁃KDA inositol1，4，5⁃triphos⁃ phate receptor，IP3R）、葡萄糖调节蛋白 75（glucose regulated protein 75，GRP75）和电压依赖性阴离子通道 1（voltage dependent anion channel1，VDAC1）是 MAM间Ca²⁺ 转移的关键分子^[11]。使用qPCR分别测定 MⅡ期卵母细胞中 IP3R、GRP75 和 VDAC1 的基因相对表达量。结果显示，高龄小鼠MⅡ期卵母细胞内IP3R的相对mRNA含量显著增高，添加腐胺后显著下降（P <0.05，图5A）。同时，高龄小鼠MⅡ期卵母细胞内GRP75的相对mRNA含量显著增高，添加腐胺后显著下降（P <0.001，图5B）。3组MⅡ期卵母细胞内VDAC1的相对mRNA 含量差异无统计学意义（图5C）。

2.6 腐胺缓解高龄小鼠期卵母细胞线粒体钙超载

分别使用 Fluo⁃4 AM、Rhod⁃2 AM 和 Mag⁃Fluo⁃4 AM测定小鼠MⅡ期卵母细胞内细胞质、线粒体和内质网Ca²⁺ 浓度，即[Ca²⁺ ]_i、[Ca²⁺ ]_m和[Ca²⁺ ]_ER（图6A）。实验表明，IVM培养液中添加腐胺能够显著缓解高龄小鼠 MⅡ期卵母细胞线粒体钙超载（P <0.001，图6B）。此外，高龄小鼠MⅡ期卵母细胞[Ca²⁺ ]_ER水平降低（P <0.001，图6C），添加腐胺后水平显著升高（P <0.001，图6C）。而3组卵母细胞的[Ca²⁺ ]_i无显著性差异（图6D）。由此推测：高龄小鼠卵母细胞线粒体内超载的Ca²⁺ 来源于内质网，且腐胺能够通过影响MAM间Ca²⁺ 运输缓解线粒体钙超载。

2.7 腐胺改善高龄小鼠卵母细胞线粒体功能

使用JC⁃1染色评估小鼠MⅡ期卵母细胞的线粒体膜电位（图7A）。高龄MⅡ期卵母细胞线粒体膜电位水平（Δψm）显著下降（P <0.001，图7C），ATP含量下降（P <0.001，图7D），ROS水平升高（P <0.001，图7B、E）。腐胺添加恢复了Δψm（P <0.05，图7C），同时增加了 ATP 含量（P <0.01，图7D），降低 ROS 水平（P <0.001，图7E）。提示腐胺可改善高龄小鼠 MⅡ期卵母细胞的线粒体功能，缓解氧化应激。

3 讨论

女性35岁以后的卵巢储备功能迅速下降^[12]，卵母细胞的衰老使生育力降低。卵母细胞是人体中最大的细胞，对其老化的机制和过程，以及可能逆转衰老的干预研究，是目前人类拯救生育能力的重要方向之一。

卵母细胞衰老的重要机制是细胞内氧化应激失衡，氧自由基浓度增加，线粒体能量代谢功能被破坏，线粒体作为生成和处理 ROS 的重要场所，其功能紊乱加重氧化应激，造成纺锤体和染色体结构缺陷和减数分裂停滞^[13]，卵母细胞质量下降。表现为卵母细胞CG分布异常，第一极体排出率、囊胚形成率显著降低。

近年来，对细胞衰老的研究发现，内质网⁃线粒体轴的膜间距MAM变化反映了内质网应激机制的激活，从而产生Ca²⁺ 超载，导致线粒体的损伤。线粒体相关内质网膜MAM已在骨骼肌细胞、心肌细胞、神经元、肾小管上皮细胞^[14]、卵巢癌细胞等多种细胞中被验证，卵母细胞中也存在 MAM。MAM 在衰老相关疾病，如神经退行性病变、糖尿病相关病变、心血管疾病、肿瘤以及代谢疾病中多有报道^[15]。在阿尔茨海默病、肌萎缩侧索硬化和帕金森病等神经退行性病变中，MAM是其关键分子和细胞中枢。在各种神经退行性病变中发现MAM参与调节多种细胞功能失调或不足的生物反应过程，包括线粒体自噬、Ca²⁺ 转移、磷脂合成等。

通常以线粒体中邻近内质网部分的长度与其周长的比值，和内质网和线粒体间的距离作为判断 MAM数量和内部联系程度的指标^[16]。课题组前期研究已证明：小鼠卵母细胞中存在MAM结构^[17]，且过氧化处理的小鼠卵母细胞内 MAM 数量增加， MAM间距离缩短^[18]。在此基础上，本研究使用自然衰老模型，验证了高龄小鼠卵母细胞中 MAM 数量增加，和MAM间距离缩短。虽然组成MAM部分的线粒体长度占比未见显著差异，可能是由于线粒体肿胀变形，周长增加导致。

内质网是细胞内重要的Ca²⁺ 储存仓库，也是线粒体中Ca²⁺ 的重要来源。内质网和线粒体间相互靠近，即在MAM距离范围内，形成独特的高Ca²⁺ 微域^[19]。 IP3R⁃GRP75⁃VDAC1 复合体是 MAM 界面 Ca²⁺ 传输的主要工具^[11]。在猪卵母细胞中敲除 IP3R1，线粒体 Ca²⁺ 浓度显著降低^[20]。在卵巢癌细胞系中敲低 GRP75显著降低卵巢癌细胞线粒体Ca²⁺ 水平，反之，过表达GRP75显著增强了它们在MAM中的相互作用，且线粒体Ca²⁺ 水平升高^[11]。本研究发现，高龄小鼠MⅡ期卵母细胞内IP3R和GRP75在基因水平的相对表达量显著增加，同时线粒体Ca²⁺ 水平显著升高，且内质网Ca²⁺ 水平显著降低，而胞质Ca²⁺ 水平无明显变化，证明高龄卵母细胞内MAM数量增多，间距缩短，且Ca²⁺ 传输关键分子的含量显著增加，导致线粒体钙超载损伤。

线粒体Ca²⁺ 是一把双刃剑。适当水平的Ca²⁺ 可以维持线粒体功能，促进线粒体高效产能。而线粒体Ca²⁺ 超载则会导致线粒体功能紊乱和ATP生成障碍，诱导细胞凋亡^[21]。糖尿病视网膜病变中 MAM 的形成增加，导致线粒体Ca²⁺ 超载，并加速了Ca²⁺ 依赖性的细胞凋亡^[5]。肥胖诱导的骨骼肌细胞 MAM 形成增加，IP3R⁃GRP75⁃VDAC1复合体相互作用增强，在复合体的作用下进入线粒体的Ca²⁺ 积累，导致线粒体Ca²⁺ 超载和线粒体功能障碍^[16]。本研究也证实了这个过程同样发生在高龄卵母细胞的老化过程中，表现为线粒体膜电位下降，ATP 生成减少， ROS增加。

既往研究发现，腐胺可以通过调节抗氧化系统和减少ROS的产生缓解氧化应激^[9]。同时，腐胺可以通过恢复卵母细胞成熟潜能，降低老龄小鼠卵母细胞的非整倍性^[22]，改善卵母细胞和胚胎质量，降低流产率^[8]。卵母细胞体外成熟是一种辅助生殖技术，目前主要应用于多囊卵巢综合征的患者，以及恶性肿瘤患者的生育力保存。近年来 IVM 培养方法取得了重大进展，推动其在临床中的常规应用^[23]。笔者课题组的前期研究发现，在IVM液中添加腐胺有助于衰老小鼠卵母细胞的成熟和胚胎发育，且对其后代具有遗传和整体表观遗传学的长期安全性^[24]。与既往研究一致，本研究观察到在IVM 液中添加腐胺能够促进卵母细胞成熟，高龄小鼠腐胺组的卵母细胞中 MAM 数量减少，内质网和线粒体间距离增加，Ca²⁺ 传输关键分子的含量显著降低，线粒体钙超载显著缓解，并因此改善了线粒体功能，缓解了氧化应激。

本研究表明，腐胺可以通过减少高龄小鼠卵母细胞内异常增多的MAM，并使内质网和线粒体间距离增加，降低二者间Ca²⁺ 传输关键分子的含量，从而减少 Ca²⁺ 传递，缓解线粒体钙超载，恢复线粒体功能，最终改善高龄卵母细胞质量，为卵母细胞抗衰老的干预方法提供了新线索，成为腐胺临床应用的新证据。

参考文献