流行病学调查显示，全球约有14.3%的人群患慢性肾脏病（chronic kidney disease，CKD）^[1]，2022年亚洲成年CKD患者总数已高达4.343亿，我国CKD患者总数高达1.598亿，占全国人口的10.8%，其中晚期 [依据估算肾小球滤过率（estimated glomerular filtra⁃ tion rate，eGFR）<30 mL/（min·1.73 m²）标准]患者数量突破2 640 万^[2]，2040 年 CKD 或将成为前 5 位死亡原因之一^[3]。CKD 进展至终末期肾病（end stage renal disease，ESRD）后依赖透析或肾移植维持生命，给患者家庭和社会带来沉重负担。根据中国 CKD营养治疗临床实践指南（2021版），CKD 1~2期糖尿病肾病（diabetic kidney disease，DKD）患者避免高蛋白摄入[>1.3 g/（kg·d）]，建议蛋白质摄入量为0.8 g/（kg·d），建议CKD 3~5期非糖尿病患者低蛋白饮食[0.6 g/（kg·d）]或极低蛋白饮食[0.3 g/（kg·d）]，联合补充酮酸制剂^[4]。我国广大居民习惯以大米为主食，稻米蛋白质含量约占糙米干质量的8%~10%，其中主要为可溶性谷蛋白（含量60%~75%），已超过 KDOQI（Kidney Disease Outcome Quality Intiative）指南中关于肾脏疾病患者4%可溶性蛋白摄入量的要求^[5]，因而长期食用正常谷蛋白大米会加重CKD患者的肾脏负担，更易发生ESRD。因此，本研究旨在研究低谷蛋白（low⁃glutelin，LG）大米延缓CKD小鼠肾功能恶化的作用，为CKD患者日常饮食和营养干预提供新的手段和理论依据。

1 材料和方法

1.1 材料

本研究大米选用LG大米（LG 香粳，江苏农科院）和正常谷蛋白（normal⁃glutelin，NG）大米（南粳 46，江苏农科院），采用全自动凯氏定氮仪（Kjeltec 8400，FOSS公司，丹麦）测量米粉中的全氮含量，再乘以换算系数 5.95 计算总蛋白含量。取精米粉 0.5 g，用提取液按顺序依次提取4种蛋白质，即清蛋白（10 mmol/L Tris⁃HCl，pH 7.5）、球蛋白（1 mol/L NaCl，10 mmol/L Tris⁃HCl，pH 7.5）、醇溶蛋白（体积分数为55%的正丙醇，10 mmol/L Tris⁃HCl，pH7.5）和谷蛋白（质量分数为0.24%的CuSO₄·5H₂O，1.68%的 KOH，0.5%的酒石酸钾钠和体积分数为50%的异丙醇）。每次提取液用量为25 mL，室温下振荡2 h，其后于4 000 g离心10 min。清蛋白、球蛋白和醇溶蛋白的测定采用考马斯亮蓝法，谷蛋白的测定采用双缩脲法，分别计算4种蛋白的含量和所占比例，用凯氏定氮仪测定的总蛋白含量对各组分含量进行换算^[6]。每个样品测定 3 次，取平均值。各组大米蛋白含量见表1。

1.2 方法

1.2.1 实验小鼠分组

6~8 周龄无特定病原体（specific pathogen free， SPF）雄性BALB/c小鼠购自南京医科大学实验动物中心，体重23~25 g，共96只。采用随机数字法分为 CKD、CKD⁃Control组，以及DKD、DKD⁃Control组，每组又分为LG大米喂养组（分别为LG⁃CKD、LG⁃CKD⁃ Control 和 LG⁃DKD、LG⁃DKD⁃Control）和 NG 大米喂养组（NG ⁃CKD、NG ⁃CKD ⁃Control 和 NG ⁃DKD、NG ⁃ DKD⁃Control），每组12只。小鼠饲养于SPF屏障中，适应性饲养 1 周，保持恒温 25℃，相对湿度 70%的环境，12 h光/暗循环，自由摄入大米和水。本研究符合3R原则，已通过南京医科大学动物伦理委员会批准（IACUC⁃2311001）。

1.2.2 阿霉素诱导的CKD小鼠模型的构建

用随机数字法将 SPF 级 BALB/c 小鼠分为对照组（CKD⁃Control）和CKD组。CKD组小鼠尾静脉单次注射阿霉素（10 mg/kg），CKD⁃Control组小鼠尾静脉单次注射同体积生理盐水。造模8周检查24 h尿蛋白（24⁃hour urinary protein，24 h UPro）定量，CKD组与CKD⁃Control组有显著差异，且差异≥50 mg^[7] 确认为模型成功。

1.2.3 DKD小鼠模型的构建

通过高脂高糖饲料喂养小鼠 4 周，再连续 5 d 腹腔注射 55 mg/kg 链脲佐菌素建立小鼠 DKD 模型^[8]；另取24只小鼠作为对照组（DKD⁃Control），以基础饲料喂养，同时腹腔注射相应剂量的柠檬酸钠缓冲液。注射结束1周后测量小鼠随机血糖和24 h UPro，以血糖≥16.7 mmol/L，且24 h UPro≥30 mg/dL为 DKD小鼠模型建立成功的标准^[9]。

1.2.4 血液学相关指标的检测

在造模成功后，分别喂养LG大米和NG大米，每周测量小鼠体重，第16周后眼眶取血，3 000 r/min、 4℃离心 10 min（离心半径 10 cm），分离血清，于-18℃冰箱保存待测。血常规检测使用全自动血细胞分析仪。参照试剂盒说明书操作，检测血尿素氮 （blood urea nitrogen，BUN）、肌酐（serum creatinine， sCr）、胱抑素（cystatin C，Cys C）、空腹血糖（fasting blood glucose，FBG）、总胆固醇（total cholesterol，TC）、甘油三酯（triglyceride，TG）、视黄醇结合蛋白（retinol binding protein，RBP）等指标。

1.2.5 尿微量白蛋白/尿肌酐比值（urinary albumin⁃ to⁃creatinine ratio，mAlb/Cr）、24 h UPro定量检测

在造模成功后，分别喂养 LG 大米和 NG 大米，于第8周和16周分别收集小鼠尿液，将小鼠转移至代谢笼，禁食不禁水，收集24 h尿液后测定尿量，混匀后取1 mL，2 000 r/min、4℃离心（离心半径10 cm） 10 min，去除沉渣后留取上清液于-20℃冰箱保存。参照试剂盒说明书操作流程，测定 mAlb/Cr、24 h UPro等指标。

1.2.6 Masson染色

在造模成功后，分别喂养小鼠 LG 大米和 NG 大米 16 周，异氟烷吸入麻醉小鼠后颈椎脱位法处死。肾组织用4%多聚甲醛固定，梯度乙醇脱水，二甲苯透明，浸蜡包埋，4 μm切片，Masson、HE染色后光镜下观察肾组织病理学变化^[10]。肾间质纤维化评分依据Masson染色，按阳性区域面积评分：0分，无；1分，<25%；2分，≥25%~50%；3分，≥50%~75%； 4分，≥75%。200倍光学显微镜下每张切片随机观察 10个不重叠视野，取平均值作为肾小管损伤的指标。

1.2.7 转录组学分析

喂养16周处死小鼠后取出肾脏，将左肾立即浸入RNAlater溶液中，4℃过夜后转至-80℃保存。使用RNeasy Mini Kit 提取总 RNA。RNA 完整性通过 Agilent 2100生物分析仪评估，仅RIN值>8的样本用于后续实验。利用 NEBNext Ultra Ⅱ Directional RNA Library Prep Kit构建文库。在Illumina NovaSeq 6000平台上进行150 bp双端测序，每个样本产生约 40 million读段。原始数据经FastQC质控和Trimmo⁃ matic过滤后，使用STAR将清洁读段比对到小鼠参考基因组（GRCm39）。采用 FeatureCount 进行基因表达定量。差异表达分析使用 DESeq2 进行，设置标准为|log₂FoldChange| ≥ 1 且调整后 P 值（FDR）<0.05。使用clusterProfiler 进行KEGG富集分析。对差异表达基因进行 GO富集分析，对其功能进行描述 （结合 GO注释结果）。根据GO分析的结果结合生物学意义挑选用于后续研究的基因。利用 KEGG数据库对差异蛋白编码基因进行Pathway分析。

1.3 统计学方法

使用SPSS 22.0软件进行统计学分析，符合正态分布的数据用均数±标准差（$\stackrel{-}{x}\pm s$）表示，偏态分布数据则以中位数（四分位数）[M（P₂₅，P₇₅）]表示，两独立样本的比较采用t检验，P <0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 各组小鼠摄食和体重变化

每日记录每只小鼠摄食量，汇总分析后可见同一时间点 LG⁃CKD 组和 NG⁃CKD 组、LG⁃DKD 组和 NG⁃DKD 组小鼠的平均摄食量差异无统计学意义 （图1），但 DKD 小鼠的摄食量明显高于 CKD 小鼠，表明LG大米或NG大米的口感、性状并未影响小鼠的正常进食。监测各组小鼠体重发现，随着喂养时间的延长，各组小鼠均能正常生长发育，干预 8 周后，NG⁃DKD小鼠的体重较LG⁃DKD小鼠下降，但差异无统计学意义，考虑与糖尿病进展相关；NG⁃DKD ⁃Control组体重下降考虑与进食NG大米有关（图2）。

2.2 LG干预对各组小鼠血清指标的影响

采用不同蛋白水平的大米喂养CKD和DKD小鼠16周，比较LG大米喂养组和NG大米喂养组，两组小鼠的红细胞（red blood cell，RBC）、白细胞（white blood cell，WBC）、血红蛋白（hemoglobin，Hb）、血小板（platelet，PLT）等血常规指标，差异无统计学意义 （图3），血清总蛋白（total protein，TP）、白蛋白（albu⁃ min，ALB）、丙氨酸氨基转移酶（alanine aminotrans⁃ ferase，ALT）、天门冬氨酸氨基转移酶（aspartate ami⁃ notransferase，AST）、血钾（K⁺）、血钠（Na⁺）等指标差异也均无统计学意义（图4），表明LG大米喂养小鼠并未造成低蛋白血症等营养不良表现。

2.3 LG干预对CKD小鼠肾功能的影响

不同大米喂养 16 周，LG⁃CKD 组较 NG⁃CKD组小鼠的BUN、sCr、Cys C水平降低，差异均有统计学意义（P 值分别是0.004、0.030、0.010），尿酸（uric ac⁃ id，UA）的差异没有统计学意义，表明喂养 LG 大米可延缓CKD小鼠肾功能恶化的进展（图5）。

2.4 LG干预对CKD小鼠尿液的影响

采用LG或NG大米喂养CKD及CKD⁃Conrtol小鼠，8周时LG⁃CKD与NG⁃CKD组尿量、mAlb/Cr、24 h UPro差异无统计学意义。第16周LG⁃CKD组mAlb/Cr 和24 h UPro定量较8周时明显降低（P值分别0.040 和0.001），尿量较8周时增加（P=0.043），而NG⁃CKD 组尿量较LG⁃CKD组明显降低（P=0.002，图6），结果表明长期LG饮食干预可降低小鼠24 h UPro，对肾脏具有一定的保护作用。

2.5 LG干预对DKD小鼠血糖、血脂影响

不同大米喂养16周，LG⁃DKD组较NG⁃DKD组的FBG下降，差异有统计学意义（P=0.002），TC、TG、 RBP水平组间差异无统计学意义，表明采用LG大米喂养可改善DKD小鼠的血糖变化（图7）。

2.6 LG对CKD和DKD小鼠肾脏病理的影响

喂养16周后，与LG⁃CKD⁃Control组比较，LG⁃CKD 组肾小球间质未见系膜细胞增生，毛细血管袢无塌陷，肾小管基底膜增厚不明显，未见肾小管管型，未出现空泡样病变，管腔扩张，部分肾小球纤维化及间质纤维无增生，提示LG大米喂养延缓CKD小鼠的肾功能恶化。与LG⁃DKD⁃Control组比较，LG⁃DKD组小鼠未见明显肾小球萎缩、无基膜增厚，肾小球内无空泡形成，肾小囊未见变窄，肾小管水肿不明显 （图8、9）。NG⁃CKD⁃Control与NG⁃DKD⁃Control组肾组织肾小球结构完整，清晰、肾小管上皮细胞排列规则，Masson染色未见间质纤维化。NG⁃CKD组HE 染色可见肾小管出现不同程度的扩张与变形，Masson 染色显示明显的纤维化增生。NG⁃DKD组HE染色可见肾组织肾小球体积增大且基底膜增厚，肾小管结构紊乱，且部分空泡变性，Masson 染色显示肾小管间质轻度纤维化。NG⁃CKD与NG⁃DKD组的病理结果也提示造模成功（图10、11）。Masson 评分显示，LG 大米喂养的 LG ⁃CKD ⁃Control 组、LG ⁃DKD ⁃ Control组、LG⁃CKD组、LG⁃DKD组分别是（5.5±0.5）、 （5.3±0.5）、（5.2±0.4）、（7.2±0.4）分，差异有统计学意义（P <0.05）；NG 大米喂养的 NG⁃CKD⁃Control 组、 NG⁃DKD⁃Control组、NG⁃CKD组、NG⁃DKD组分别是 （5.4±0.5）、（5.6±0.8）、（14.2±0.7）、（11.8±0.6）分，差异有统计学意义（P <0.05）。

2.7 基于RNA⁃Seq的LG⁃CKD组和NG⁃CKD组小鼠肾脏转录组分析

LG 或 NG 大米喂养 16 周后的 LG ⁃CKD 组和 NG⁃CKD 组小鼠，差异表达基因 4 026 个，其中上调 2 152个，下调1 874个，富集分析和热图分析发现JAK⁃STAT通路是延缓CKD小鼠肾纤维化进展的潜在机制（图12）。

3 讨论

我国是亚洲CKD发病率最高的国家^[2]，营养治疗是CKD的主要干预措施之一，在延缓CKD进展及并发症防治中均发挥重要作用。鉴于我国居民饮食习惯以大米为主的特点，研发LG 大米为CKD 患者提供了切实可行的预防与治疗新途径，对改善 CKD患者预后、提升其生活质量具有重要意义。

目前CKD患者的最主要病因是糖尿病，因此本研究选用了CKD模型以及DKD模型。本研究结果表明用 LG 大米喂养小鼠并未有低蛋白血症、贫血等营养不良表现。LG大米中谷蛋白水平明显低于 NG大米，但是脂肪、碳水化合物等其他营养物质含量与 NG 大米基本一致，因此这两种模型都显示出良好的适应性，避免了单纯低蛋白饮食带来的体重减轻、贫血，也避免了人为剔除蛋白质，食物口感降低和蛋白摄入不足，出现营养不良等不良反应。

本研究结果，CKD模型中LG⁃CKD组较NG⁃CKD 组 BUN、sCr、Cys C 皆明显下降，16 周时 LG⁃CKD 组 mAlb/Cr 和 24h Upro 较 8 周时明显降低，表明 LG 大米可延缓肾功能恶化，LG⁃DKD组血糖指标改善。

LG 大米在CKD 和DKD 患者中的治疗机制，初步分析如下：本研究中供试样品 LG 大米由具有低直链淀粉含量基因 Wxmp 和香味基因 fgr 的优良食味粳稻品种南粳46与含LG基因Lgc1的日本粳稻品种Lgc⁃1杂交、回交，是通过分子标记辅助选育的特殊营养功能大米，其不能被人体消化吸收的醇溶蛋白（4.47 g）比 NG 大米的醇溶蛋白（1.78 g）明显增加^[6]，使蛋白吸收明显下降，减少氨基酸的摄入，减轻氮质血症和肾组织病理损伤，从而延缓ESRD 的进展。研究表明，JAK⁃STAT 通路激活可致足细胞特异性损伤，系膜扩张、肾小球基底膜增厚和小管间质纤维化^[11]，CD8 ⁺ 组织常驻记忆 T 细胞（tissue⁃ resident memory T cell，TRM）在CKD中的比例增加，促进足细胞损伤和肾小球硬化^[12]。据报道，JAK/ STAT通路抑制剂Tofacitinib可有效抑制MRL/lpr小鼠肾CD8⁺ TRM细胞产生肿瘤坏死因子⁃α、干扰素⁃γ 和颗粒酶B，从而抑制CD8⁺ TRM细胞功能，改善肾功能^[13]。本研究转录组学结果与其他研究一致，表明JAK⁃STAT通路是参与CKD的调控基因。CKD中 JAK2、STAT1、STAT3 和 STAT5 的高表达，而抑制 JAK/STAT通路可以减少转化生长因子⁃β和纤维连接蛋白的合成，抑制STAT3可以减缓肾纤维化的进展，减少巨噬细胞和炎症细胞因子的产生^[14]。Kitada 等^[15] 研究表明，LG 饮食通过限制氨基酸降低 mTORC1活性来调节肾脏自噬，减轻肾小管间质损伤^[16]，增加血液中的成纤维细胞生长因子⁃21 的含量，降低血糖浓度，促进胰岛β细胞再生^[17]。LG 饮食既能控制 DKD 小鼠的血糖波动，又能延缓 DKD 肾功能受损的症状，因此，作为必不可少的主食，LG 大米的应用就显得尤为重要。

综上所述，基于CKD和DKD的严峻形势和居民自我健康管理意识的不断增强，饮食干预对慢性病的预防和治疗具有可观的研究价值。然而，本研究也存在一定缺陷，仅研究了 LG 大米在阿霉素诱导的CKD小鼠和高脂高糖饮食联合链脲佐菌素诱导的 DKD模型小鼠中的作用，未进行其他CKD模型、糖尿病模型及大鼠模型的研究，未来将完善相关临床研究，进一步阐明食用LG大米改善CKD和DKD肾功能的机制。

利益冲突：

本研究所用大米的蛋白含量检测为江苏宜盛堂生命科技有限公司提供，但该公司未参与本项目的其他研究。

参考文献