布鲁氏菌病简称布病，是由布鲁氏菌感染引起的一种人畜共患病。布鲁氏菌感染家畜后可随病畜的分泌物、排泄物等排至环境中，通过皮肤、黏膜、消化道和呼吸道等途径感染人体^[1]。目前布病的实验室诊断方法包括细菌培养、免疫学诊断及分子生物学方法等。病原菌培养是诊断布病的金标准，但此方法存在耗时长、灵敏度低^[2]、需要具备实验室资质的人员以及生物安全3级设施等缺点。免疫学诊断如试管凝集试验、玫瑰孟加拉板试验和补体固定试验等都是基于对布鲁氏菌光滑菌株细胞壁多糖抗原与患者血清抗体的检测，具有试验操作简单且耗时短，成本低等优点，但也存在一定的局限性，如灵敏度有限、易与其他细菌交叉反应导致假阳性使结果难以解释、无法区分现症感染和既往感染^[3]，完全治愈的患者其免疫学凝集结果可能会在很长一段时间内持续出现阳性，干扰临床诊断和治疗^[4]。

布鲁氏菌属于革兰阴性小球杆菌，是兼性细胞内寄生菌，没有鞭毛和芽孢，光滑型有微荚膜，通过逃避宿主吞噬细胞功能在宿主细胞中建立慢性感染^[5]。内毒素是革兰阴性菌的细胞壁产物，主要化学成分是脂多糖（lipopolysaccharide，LPS）的类脂 A 成分，LPS作为布鲁氏菌主要毒力因子之一，在感染早期可诱导中性粒细胞死亡且不刺激炎症反应，从而实现免疫逃逸。定量检测血液中LPS可以辅助诊断布鲁氏菌感染。本研究旨在评价LPS检测对布病的诊断价值以及LPS联合血培养对患者治疗效果的评价作用，以期为临床医师早期诊断布病和布病疗效评价提供依据。

1 对象和方法

1.1 对象

收集南京医科大学第一附属医院2019年1月— 2023 年 10 月临床科室确诊的布病患者 61 例，根据卫生部《布鲁氏菌病诊断标准》（WS 269-2019）^[6] 分为现症布病组（39例）和布病治疗有效组（22例）。现症布病组：具有发热、关节肌肉疼痛等相关临床表现，发病前患者有布鲁氏菌或布鲁氏菌感染动物/农畜产品接触史/食用史，同时具备任一确诊试验阳性或初筛检查结果阳性者^[7]；本研究现症布病组包括首诊组（32 例）和布病治疗无效组（7 例），布病治疗无效组为患者经过12周治疗后，复查症状未缓解，同时确诊试验仍为阳性者。布病治疗有效组为布病患者经过治疗12周后，复查症状缓解，任一确诊试验阴性者。本研究布病患者使用虎红平板凝集试验（rose Bengal plate agglutination. test，RBT）进行初筛试验，以病原学标本分离培养到布鲁氏菌作为确证试验。收集南京医科大学第一附属医院2023年 9月健康体检人群20例作为正常对照组。

布病患者纳入标准：病例资料完整；有布鲁氏菌接触史和发热、乏力等相关临床症状；未合并其他细菌、病毒、真菌感染。排除标准：病例资料不完整；合并心脑血管等重要器官障碍；合并严重肝肾功能异常病例；合并血液系统疾病和实体肿瘤等病例。健康体检人群均排除肿瘤、肝炎、贫血和感染性疾病。本研究经南京医科大学第一附属医院伦理委员会批准，伦理批件号为2024-SR-595。

1.2 方法

所有病例进行血培养，并抽取空腹静脉血3 mL 于去内毒素真空采血管，3 500 r/min离心分离血清用于RBT和LPS检测，现症布病患者入院检查确诊后进行 LPS 定量检测，同时检测治疗 12 周后患者 LPS水平。血培养选用Bactec FX400全自动血培养仪，美国 BD 公司的含树脂需氧瓶和含溶血素厌氧瓶；RBT 选用辽宁迪浩生物科技公司试剂，等量菌液与血清混合，观察试剂中细菌细胞壁LPS抗原与患者血清中相应抗体是否会产生肉眼可见的凝集现象，任何程度的凝集和结块均被认为是阳性反应，未出现凝集或无结块被认为是阴性反应。LPS 检测选用北京金山川公司IGL-800真菌/细菌动态检测仪和革兰阴性菌脂多糖检测试剂盒（光度法），以 LPS定量结果<10 pg/mL判读为阴性；>10 pg/mL判读为阳性。全部研究对象均接受血培养、RBT 和 LPS检测，分析3种检测的阳性率，对比诊断的灵敏度、特异度、准确度以及联合诊断的诊断效能。

1.3 统计学方法

应用SPSS 22.0 软件对数据进行分析，计数资料以例数（百分率）[n（%）]表示，计量资料以中位数 （四分位数）[M（P₂₅，P₇₅）]表示。以四格表法分析血培养、RBT试验、LPS检测对现症布病和布病治疗有效的诊断价值。不同检测方法之间的灵敏度、特异度、准确度等比较采用Pearson χ² 检验。采用受试者工作特征（reciever operating characteristic，ROC）曲线分析血培养、RBT试验、LPS检测两两联合以及三者联合对布病治疗效果的评估价值。P <0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 布病流行病学特征

本研究61例布病患者中，男45例（73.77%），女 16 例（26.23%），男性患者数量显著高于女性，差异有统计学意义（P <0.05）。患病年龄中位数为 52（45，58）岁，最小为 19 岁，最大为 75 岁，主要发病年龄段集中在 45~60 岁，共 36 例，占患者总数的 59.02%。不同季节布病患病率结果显示，夏季和春季是疾病高发期，夏季 25 例（40.98%），春季 19 例（31.15%），冬季 8 例（14.75%），秋季 8 例 （13.11%）。61 例布病患者中，52 例（85.25%）来自农村；40 例（65.57%）是农民或者养殖业者，3 例 （4.92%）从事兽医行业；48例（78.69%）有明确动物接触史（羊 46 例，75.41%）。现症布病组和布病治疗有效组各流行病学指标差异无统计学意义，结果见表1。

2.2 临床症状和实验室指标

与现症组患者相比，布病治疗有效组患者发热症状显著缓解，腰疼、乏力、关节痛、寒战、头痛、咳嗽和腹泻等症状发生率降低，但与现症组患者相比差异无统计学意义。两组患者白细胞计数差异无统计学意义，治疗有效组丙氨酸氨基转移酶（ala-nine aminotransferase，ALT）、天门冬氨酸氨基转移酶 （aspartate aminotransferase，AST）、血沉（erythrocyte sedimentation rate，ESR）、C反应蛋白（C-reactive pro-tein，CRP）、降钙素原（procalcitonin，PCT）水平显著降低（P <0.05）。LPS实验结果39例现症组阳性检出率为 100.00%，22 例治疗有效组检出 10 例阳性，阳性检出率为45.45%，治疗有效组LPS实验阳性检出率显著低于现症组（P <0.05）。血培养39例现症组患者检出32例阳性，阳性检出率82.05%，22例治疗有效组结果均为阴性，差异有统计学意义（P <0.05）。 RBT 试验 39 例现症组患者检出 38 例阳性，阳性检出率为97.44%，22例治疗有效组检出20例阳性，阳性率为90.91%，差异无统计学意义（表2），RBT试验结果见图1。

2.3 血培养、RBT和LPS检测的诊断效能比较

对于现症布病和布病治疗有效的诊断效能，血培养特异度和阳性预测值为 100%，准确度为 88.52%，均高于 LPS 和 RBT 检测，但其检测灵敏度低于LPS和RBT检测，阴性预测值低于LPS检测，高于RBT检测；RBT检测灵敏度低于LPS检测，高于血培养，特异度、阳性预测值、阴性预测值以及准确度均最低；LPS检测灵敏度和阴性预测值为100%，特异度、阳性预测值、准确度低于血培养，高于 RBT （表3）。

2.4 血清LPS水平对布病的诊断和疗效评价

所有标本进行LPS定量检测，对照组LPS定量结果中位数为5.00（5.00，9.91）pg/mL。39例现症布病患者包括32例首诊组患者，7例治疗无效组患者，首诊组 LPS定量结果中位数为38.46（25.84，116.20）pg/mL，治疗无效组 LPS 定量结果中位数为 37.96（28.32，116.20）pg/mL，均显著高于对照组，差异有统计学意义（P <0.05），首诊组和治疗无效组两者之间LPS定量结果差异无统计学意义。治疗有效组LPS定量结果中位数为5.00（5.00，48.85）pg/mL，较首诊组和治疗无效组含量均显著降低，差异有统计学意义（P <0.05，图2）。

2.5 血培养、RBT和LPS检测在布病疗效评价中的价值分析

绘制血培养、RBT、LPS检测诊断布病的ROC曲线，以血培养结果、RBT 和 LPS 结果为独立检验变量，对其赋值如下：血培养阴性赋值0，血培养阳性赋值1；RBT结果阴性赋值0，RBT结果阳性赋值1； LPS <10 pg/mL 赋值 0，LPS≥10 pg/mL 赋值 1，并以 Logit（P）作为两两联合及三项联合检验变量进行多变量ROC曲线分析，结果见图3。血培养联合RBT、血培养联合 LPS、RBT 联合 LPS 和三项联合的 AUC 分别为0.914、0.957、0.779和0.959，血培养联合LPS 和三项联合均具有较高的诊断价值，而三项联合的 AUC值相比血培养联合LPS增加不显著，故选择血培养联合LPS作为布病疗效评价指标。三项联合诊断价值不高。根据Youden指数最大时作为临界值，血培养联合LPS 的灵敏度为82.1%，特异度100.0% （表4）。

3 讨论

因畜牧业以及旅游业的迅速发展，目前我国布病流行地域从内蒙、新疆等北方牧区不断扩大，已波及31个省份，危害巨大^[8]。本研究患者主要来自江苏及其周边地区，结果显示布病患者主要以来自农村，从事养殖业，年龄在40岁以上中老年男性为主（60.46%），布病四季均有发生，春夏两季是高发季，占总病例的72.13%，与既往报道一致^[9-10]。中老年男性是从事畜牧养殖业、屠宰工人、兽医等职业的主力军，自我保护意识较弱，感染风险高，是其患病率显著高于女性的主要原因。春夏两季气温适宜，菌体容易存活，动物处于繁殖高峰，带菌排泄物或肉奶制品等感染人类的风险增高。土耳其等一些布病流行国家该菌的传播主要为食用生牛奶或牛奶制品等食源性暴露^[11]，而我国布病的主要传播方式是接触传播^[12]，本研究中80%的病例具有病畜接触史，其中羊占75.41%，接触方式以养殖为主，其次是宰杀或接生。

布病治疗有效后，ALT、AST、ESR、CRP、PCT等实验室检查结果恢复正常。但临床症状仅发热出现显著好转，腰疼、乏力、关节痛等症状虽发生率降低，但与现症组无显著差异。布病临床症状多样且存在非特异性，实验室确认诊断对患者的诊断和治疗至关重要。目前本实验室可通过病原学培养进行直接诊断及通过免疫学试验辅助诊断。但具有培养耗时长^[13]、鉴定难度高、诊断灵敏度偏低以及实验室生物安全要求高等缺点。本研究对61例布病患者研究发现，39例现症患者血培养检出32例阳性，培养报阳时间为90.3（69.1，103.2）h，另有7例现症患者未检出阳性，假阴性的原因可能为细菌生长缓慢，培养时间不足，用药导致细菌活力降低或死亡等。血培养用于布病诊断的特异度和阳性预测值均为 100%，但灵敏度和阴性预测值分别为 82.05%和75.86%，易造成布病的漏诊。免疫学方法操作简单、可以实现快速诊断且检测费用低^[14]。 RBT是目前检测布病的常用免疫学诊断方法之一，灵敏度高，本研究中RBT试验的诊断灵敏度分别为 97.44%，只有1例现症患者RBT法未检出阳性，究其原因是待检抗体量和常规使用的试剂量不匹配，出现勾状效应，使结果出现假阴性。RBT通过检测布鲁氏菌脂多糖O链的抗体进行诊断，而O链是多种革兰阴性菌的共同抗原，因此易与部分其他革兰阴性菌发生交叉反应，使其特异度较低。

LPS 是布鲁氏菌细胞壁外膜成分，也是 LPS 的主要毒力因子之一，当菌体裂解后可释放入血。本研究中对首诊组患者 LPS 定量结果显示中位数为 37.96（5.00，86.01）pg/mL，显著高于正常对照组。治疗12周后，治疗无效组LPS水平仍显著高于正常对照组（37.96 pg/mL vs.5.00 pg/mL），治疗有效组水平显著低于首诊组和治疗无效组，并与正常对照组差异无统计学意义，对治疗12周后患者LPS进行定量检测有助于了解布病治疗疗效。因病例数量较少，且患者多来自外地，确诊后主要回当地继续治疗，故本研究只对现症和治疗12周后的布病患者进行了LPS定量检测，结果具有一定的局限性，不能反映 LPS水平在布病治疗过程中的动态变化，后期计划增加样本量，并增加LPS检测时间点，动态监测治疗过程中LPS含量，对研究结果进行进一步验证。革兰阴性菌细胞壁外膜普遍存在脂多糖，因此LPS的特异度为 54.55%，可结合血培养、RBT 等辅助布病的诊断。

布病的治疗是医疗难题，根据2017年《布鲁氏菌病诊疗专家共识》^[15]，布病治疗需要早期、联合、足量和足疗程。本研究评估了实验室指标在布病治疗疗效评价中的作用。22例布病治疗有效患者血培养均为阴性，但不能排除布鲁氏菌活性减低或菌量减少导致的假阴性。 RBT 法的阳性率为 90.91%，因抗体可较长时间在体内存在，使 RBT 法无法区别现症感染和治疗有效^[16]。与现症布病患者相比，LPS检测值显著下降，但革兰阴性杆菌细胞壁普遍存在 LPS，单独检测 LPS 对于布病的诊断价值有限，因此本研究将LPS、血培养和RBT3种方法进行两两联合和三项联合，通过ROC曲线分析显示血培养联合LPS对于评价患者治疗疗效具有较高的临床价值，灵敏度82.1%，特异度100%。

综上所述，LPS检测可辅助诊断布病，并可用于布病疗效评价，布病患者LPS检测值显著升高，治疗有效后LPS检测值显著降低。血培养联合LPS检测既提高了诊断灵敏度，又避免RBT试验缺乏特异性和不能区分疾病感染状态的缺点，在重点人群布病的诊断和治疗过程中可以广泛应用，提高布病诊断率的同时预测疾病转归，对于降低布病传播风险，减轻患者心理压力和经济负担具有重要意义。

参考文献