随着健康意识的提高及高分辨率超声的应用，甲状腺结节的检出率越来越高。南京40岁以上成年人甲状腺结节患病率高达46.6%^[1]。甲状腺结节的临床意义主要在于鉴别良恶性、评估功能状态及是否产生压迫症状，其中良恶性的鉴别备受关注。高分辨率超声检查可以辅助判断甲状腺结节的良恶性^[2-3]，但目前尚没有某一种超声特征能够很好地提示恶性可能，均为不同超声征象的累积评分体系，同时操作者之间存在一定的变异度。目前国内外各大指南^[4-6] 均推荐甲状腺细针穿刺（fine needle aspiration，FNA）作为评估甲状腺结节良恶性的重要方法。通过FNA（必要时联合高危基因检测^[7-8]），可以有效减少甲状腺结节患者的诊断性手术，避免过度治疗，使得医疗资源配置更加合理。

细胞病理的采集制片方法决定了 FNA 标本的可读性和阳性率。目前主流的 3 种制片方法分别为传统涂片、膜式液基细胞制片和沉降式液基细胞制片^[9]。沉降式液基细胞学制片利用梯度离心方法将有效细胞成分沉降附着在玻片上，如美国 BD 公司的 SurePath 沉降式液基细胞采集方法（Sure-Path liquid-based cytology，SurePath-LBC）。有病理学家认为SurePath-LBC所得细胞团三维立体感更强，在甲状腺 FNA 领域沉降式略优于膜式液基细胞学制片^[9]。南京医科大学第一附属医院内分泌科从2014年9月开始联合病理科将SurePath-LBC应用于甲状腺FNA，前期研究提示SurePath-LBC联合传统涂片可进一步提高FNA诊断率^[10]，同时SurePath-LBC 的诊断率要高于传统涂片方法^[11]。关于 Sure-Path-LBC与手术病理诊断准确性的比较，仅有少数报道^[12-13]。本研究旨在通过与手术病理对比，进一步评估SurePath-LBC所得的细胞病理学诊断的准确性。

1 对象和方法

1.1 对象

以手术名称中包含“甲状腺”为关键词在南京医科大学第一附属医院病案室进行检索，出院时间设定为 2019 年 1 月 1 日—12 月 31 日。共计检索到 2 037份记录，去除资料不完整和非专科手术病例，共有 352 例患者纳入本研究，其中共计 363 个甲状腺结节行超声引导下FNA，所有患者在穿刺前均签署知情同意书。本研究由南京医科大学第一附属医院伦理委员会审查批准（2020-SRFA-388）。

1.2 方法

1.2.1 甲状腺细针穿刺过程

如前期研究描述^[10，14-19]：患者取仰卧位，以枕垫肩，暴露穿刺部位。使用75%的酒精进行消毒。采用高分辨率高频线阵探头（6~18 MHz，Esaote MYLAB 60，意大利）包裹无菌保护套进行超声检查和实时穿刺引导。使用国际标准化 25G 超细针 （0.5 mm×38.0 mm，Becton Dickinson 公司，美国）连接至5 mL注射器，将超声探头置于颈部病变区域皮肤表面作为引导。根据结节的部位和操作者的偏好将针头以垂直或者平行于探头的方向进针，穿刺过程中通过探头仔细观察针头或进针的路径，保证针尖在目标结节范围内。每个结节均进行多针穿刺，穿刺后穿刺针在有15 mL保存液（CytoRich公司，美国）的离心管中充分洗涤并保存。

1.2.2 细胞病理的制作与解读

将穿刺所得的细胞样本置入保存液中，静置 30 min 后进行第 1 次离心，转速 2 000 r/min 离心 10 min，离心后的样本去除上清液后加入缓冲液，再进行第 2 次离心，转速 2 000 r/min 离心 5 min，离心后的细胞样本去除上清液后上机（PREPSTAIN^TM Slide processor，TRIPath-IMAGING，E212100Prism， BD公司，美国）进行SurePath-LBC方法制片。细胞病理医师根据更新版Bethesda系统解读。即Ⅰ类：无法诊断/标本不满意（nondiagnostic，ND）；Ⅱ类：良性结节（benign，B）；Ⅲ类：意义不明的细胞不典型病变/意义不明的滤泡性病变（atypia of undetermined significance，AUS）；Ⅳ类：滤泡性肿瘤/可疑滤泡性肿瘤（follicular neoplasm，FN）；Ⅴ类：可疑恶性肿瘤 （suspicious for malignancy，SM）；Ⅵ类：恶性肿瘤（ma-lignant，M）^[20]。

1.2.3 手术与手术病理

所有手术均由经验丰富的甲状腺外科医师完成，切除的甲状腺组织按照常规流程制作病理切片，依据 2017 年 WHO 的肿瘤分类标准进行阅片。将甲状腺恶性肿瘤分为乳头状癌（papillary thyroid carcinoma，PTC）、滤泡状癌（follicular thyroid carcino-ma，FTC）、髓样癌（medullary thyroid carcinoma， MTC）和未分化癌（anaplastic thyroid carcinoma， ATC）。对于肿瘤直径<1 cm的PTC称为微小乳头状癌（micro-papillary thyroid carcinoma，mPTC）^[21]。

1.2.4 BRAF分子检测

对部分患者另外穿刺一针送 BRAF^V600E基因检测。按照制造商说明，使用试剂盒（ADx-ARMS，厦门 AmoyDX 公司）完成对所有细胞样本的 DNA 提取。使用 NanoDrop2000 分光光度计（Thermo 公司，美国）对分离DNA数量进行评估。应用突变扩增系统（ARMS）技术对样本进行分析。

1.3 统计学方法

使用SPSS 25.0统计学软件进行数据处理。所有定量资料采用均数±标准差（$\stackrel{-}{x}\pm s$）表示，而定性资料采用数量和百分比来表示。定量数据的比较使用独立样本t检验。P <0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 患者基本资料

352 例甲状腺结节患者中，女 249 例（70.7%），年龄（44.1±12.5）岁（21~75 岁）；男 103 例（29.3%），年龄（40.2±10.9）岁（22~65岁）。其中11例行2个结节穿刺（分别与手术病理对比），共计 363 例结节。手术病理提示：良性肿瘤15例（4.1%），恶性潜能未定的甲状腺高分化肿瘤（well differentiated tumors of uncertain malignant potential，WT-UMP）2例（0.6%）， PTC（包括 mPTC）共 341 例（93.9%），FTC 和 MTC 分别为1例（0.3%）和4例（1.1%），未发现ATC。

2.2 SurePath-LBC 学病理诊断与手术组织病理诊断对比

2.2.1 SurePath-LBC诊断为M和SM

2.2.1.1 总体符合率对比分析

细胞病理提示 SM 的甲状腺结节共计 112 例 （110 例可疑 PTC，2 例可疑 MTC），其中 110 例可疑 PTC的病例中最终手术病理确定为PTC的有106例，另 1 例为不典型滤泡性腺瘤，1 例 FTC，2 例 WT-UMP，诊断一致率为96.4%；2例细胞学可疑MTC的病例最终手术病理均证实为 MTC，诊断一致率为 100.0%。总体 SM 的病例与手术病理吻合率为 97.3%。细胞病理提示M的甲状腺结节共计211例 （210例PTC，1例MTC），在210例PTC中，最终手术病理证实为 PTC 的有 209 例，另 1 例为乳头状增生伴不典型增生，一致率99.5%；细胞学诊断为MTC的病例，手术病理也确定为MTC，一致率100.0%。总体细胞病理提示 M 的病例与手术病理吻合率为 99.5%（表1）。

2.2.1.2 液基制片图像分析

经过SurePath-LBC诊断为PTC的样本镜下可见细胞排列拥挤，具有典型的乳头状结构，细胞核明显增大、拥挤，核淡染，核内包涵体易见。而MTC镜下可见肿瘤细胞排列拥挤，细胞形态复杂，可呈多形性或者梭形，细胞核大而不规则、明显偏位，胞质有淀粉样颗粒物质沉淀（图1）。

2.2.1.3 BRAF突变检测分析

264例结节同时进行了BRAF^V600E 基因检测。在79 例（29.9%）细胞病理提示SM的结节中，BRAF^V600E 突变65例（82.3%）；157例（59.5%）细胞病理提示M 的病例中，BRAF^V600E 突变150例（95.5%）（表2）。研究表明在细胞学诊断为SM和M的病例中，BRAF^V600E 突变率较高，尤其是对于细胞学诊断为 M 的结节， BRAF^V600E 突变率高达95.5%。进一步比较细胞学和 BRAF^V600E 在FNA中的诊断价值，发现Bethesda病理系统提示为 SM 的结节，细胞学诊断的灵敏度为 98.7%，BRAF^V600E 诊断的灵敏度为 98.5%。Bethesda 病理系统提示为M的结节，细胞学诊断的灵敏度为 99.4%，BRAF^V600E 诊断的灵敏度为99.3%。

SM：suspicious for malignancy. M：malignant. PTC：papillary thyroid carcinoma. MTC：medullary thyroid carcinoma. FTC：follicular thyroid carcino-ma. WT-UMP：well differentiated tumors of uncertain malignant potential.

2.2.1.4 诊断不一致的病例分析

在细胞学诊断为SM和M中，有5例细胞病理学与最终手术病理诊断不一致的病例。4例细胞学诊断为可疑 PTC，最终 2 例手术病理为 WT-UMP，1 例为FTC，还有1例为不典型腺瘤；1例细胞学诊断为 PTC，最终手术病理提示滤泡上皮乳头状增生伴不典型增生（表3）。

2.2.2 SurePath-LBC诊断为B

细胞病理诊断为B的病例共7例（表4），手术诊断为良性肿瘤5例，另2例均诊断为mPTC。7例结节中，TI-RADS（thyroid imaging reporting and data system）3级的有4例，最小结节直径为37 mm；另外 3 例结节 TI-RADS 分级均在 4A 及以上，其中 2 例 BRAF^V600E为突变型，这 2 例最终手术病理证实为 mPTC。

SM：suspicious for malignancy. M：malignant. a：1 case with cytology as SM and BRAF^V600E mutation turned out to be papillary hyperplasia of follicu-lar epithelium with atypical hyperplasia in histology. b：1 case with cytology as M and BRAF^V600E mutation turned out to be well differentiated tumor of un-certain malignant potential in histology.

SM：suspicious for malignancy. M：malignant. TI-RADS：Thyroid imaging reporting and data system. PTC：papillary thyroid carcinoma. FTC：follicu-lar thyroid carcinoma. WT-UMP：well differentiated tumors of uncertain malignant potential.

2.2.3 SurePath-LBC诊断为AUS

AUS共计23例（表4），20例最终手术诊断为恶性（19例PTC，1例MTC）。在这23例结节中有19例 TI-RADS 分级在 4B 及以上（5 例 4B，8 例 4C，6 例 5 级），另2例4A，还有2例TI-RADS分级3级，患者本身结节直径或者合并的其他结节直径最大径>37 mm。在进行BRAF^V600E 检测的16例结节中，突变的有10例，最终手术病理均证实为PTC。

2.2.4 SurePath-LBC诊断为ND

ND共10例（表4）。其中TI-RADS 3级的有3例 （直径 41~59 mm），其余 7 例 TI-RADS 分级均在 4A 及以上，其中有4例BRAF^V600E 为突变型，这4例最终手术诊断为PTC。

3 讨论

Bethesda甲状腺细胞病理分类使得甲状腺细胞病理报告能够规范化、统一化，并给临床医师提供下一步处理的建议。按照最新版Bethesda细胞病理报告，细胞学诊断为 SM 的结节最终诊断为恶性的可能性为 50%~75%^[20]，在本研究中，SurePath-LBC 诊断 SM 的甲状腺结节与手术病理的一致率为 97.3%（可疑PTC 和可疑MTC 的诊断一致率分别为 96.4%和100.0%）。其恶性率远远高于国际报道的平均水平，甚至已经处在Bethesda系统中M类别恶性的风险（97%~99%）^[20]。一方面与本研究所入选的样本具有高度选择性有关，另一方面也提示有可能本研究中心细胞病理医师在读片时相对慎重，在把握具体诊断标准时比国际同行更加严格有关，这与国内的医疗关系与国情特点也有一定关系。本研究中细胞病理提示 M 的结节与手术病理一致率为99.5%，其中PTC的诊断一致率为99.5%，MTC的一致率为100.0%，与国际报告相一致。以上两类总体恶性一致度达到 98.8%，提示如果采用 SurePath-LBC解读细胞学结果，诊断为SM和M时，根据指南应当建议患者手术治疗^[4，20]。

从具体病理类型分析来看，细胞学不仅报告SM 或M，也提示具体的肿瘤类型。本研究在所有SM和 M 中可疑或诊断 PTC 的符合率为 98.4%，可疑或诊断MTC的符合率达到100.0%。本研究高度一致的符合率提示，通过SurePath-LBC方法采集的细胞能够比较真实地反映大体病理的特点，当然这也与细胞病理医师多年阅片经验的积累有关。从这个角度上说，细胞学诊断不仅可提示是否为恶性，而且对于何种恶性类型也具有非常重要的提示价值，尤其是对于比较容易忽视的恶性度相对更高的 MTC。因为MTC发病率相对较低，同时目前指南对于是否查降钙素也并非常规推荐，在这样的情况下，细胞学诊断就显得尤其重要，可以在手术前即了解该例患者有没有MTC的可能。

很长时间以来国内细胞学领域发展相对落后，导致很多外科医师仅凭超声即作出是否手术以及如何手术的决定。目前经过多年的发展和积累，尤其是 SurePath-LBC 采集方法联合甲状腺 FNA 的应用使得临床医师能够术前通过常规穿刺了解是否为恶性或潜在恶性及具体类型。因此SurePath-LBC 采集样本的方法具有非常重要的临床应用价值。 SurePath-LBC技术相比传统涂片最显著的优点是采集的标本保证每一张载玻片上的细胞均为单层、薄片状的，而且标本在采集后的6个月里能够稳定保存，因此剩余的细胞标本可用于其他检查。这就为甲状腺 FNA 常见体细胞突变的免疫细胞化学评价和分子检测提供可能性^[22-24]。国内外已有许多研究报道显示，FNA联合BRAF^V600E 突变检测提高了PTC 的诊断准确率^[25-27]。

BRAF^V600E突变检测在所有甲状腺分子标志物中特异性较高，同时检出率高，另外价格相对更加低廉，受到国内外很多中心的关注。本研究发现尽管在细胞学诊断为SM、M的病例中，BRAF^V600E 突变率较高，分别为82.3%和95.5%，但其诊断灵敏度仍低于细胞学。国际上通常的做法一般是在细胞学未定型时建议再进行分子检测，往往需要患者进行 2次穿刺。本中心考虑国情及患者便利性同时进行了细胞学和BRAF^V600E 的检测。虽然严格意义上说， SM也属于细胞学未定型类别，但是本研究数据提示一方面 SM 与恶性的符合率较高，已经类似于国际报道的M类别，另一方面BRAF^V600E 的突变率虽然较高但是诊断灵敏度仍低于细胞学。对于尚没有条件开展BRAF^V600E 或者基因诊断的医疗机构，细胞学若诊断为 SM 或 M 高度提示恶性风险，应当建议患者手术治疗，并不一定需要对 SM 类别进行二次穿刺检测BRAF^V600E 突变或者其他分子标志物。

a：FNA was done for nodules of both thyroid lobes with larger one on right side as 37 mm. b：Cytological diagnosis tended to be lymphocytic thyroid-itis，surgical pathology suggested micro-papillary thyroid carcinoma surrounded with features of Hashimoto’s thyroiditis. c：Cytological diagnosis showed a small amount of Hürthle cells and more lymphocytes，indicating lymphocytic thyroiditis. Surgical pathology suggests micro-papillary thyroid carcinoma，and the surrounding tissue showed nodular goiter with chronic lymphocytic thyroiditis. d：Goiter with cystic change，occult PTC with diame-ter<2 mm was found in the central area. B：benign. AUS：atypia of undetermined significance. ND：nondiagnostic. NA：not available. PTC：papillary thy-roid carcinoma. mPTC：micro-papillary thyroid carcinoma. MTC：medullary thyroid carcinoma.

SurePath-LBC 也具有一定的假阳性，可能由于穿刺样本不具有代表性、染色及处理过程、细胞制片等原因^[28]，发生率为 2%~10%^[29-30]。本研究细胞学诊断为SM和M的病例中尚有5例与最终手术病理不一致的情况。通过将详细的细胞学诊断和组织学诊断进行对比（表3）发现：4例细胞学诊断为可疑 PTC 的病例中，2 例手术病理为 WT-UMP，1 例为 FTC，还有1例为不典型腺瘤。WT-UMP其实是一种介于良性和恶性之间的肿瘤，这种肿瘤从细胞学是很难做出诊断的，必须根据组织学来界定，也提示细胞学已经发现其形态异常，某种意义上说也是符合的；另外1例为FTC，FTC的诊断即使在大体病理也是难点，更不用说从细胞学诊断，从可疑癌的大类上说，本例其实也是符合的，仅仅是类别不同；还有1例为不典型滤泡腺瘤，不典型也就意味着细胞学也有相应的异常。另外 1 例细胞学诊断为 PTC，最终手术病理提示滤泡上皮乳头状增生伴不典型增生，虽然不属于恶性，但是不典型增生也提示了该例患者可能存在的细胞学异性。以上结果提示细胞学诊断总体仍有其不可避免的局限性，但是应当看到大部分符合率是很高的，从不符合的病例看，组织学也具有一定潜在异型性。

本研究有7例细胞学诊断为B。从结节的大小看，7例中有4例最长直径均超过3.5 cm，手术均证实为良性，与细胞学诊断吻合。另外3例相对较小 （5 mm以内）。均进行了BRAF^V600E 检测，1例阴性手术符合良性，另外 2 例 BRAF^V600E阳性，手术证实为 mPTC 且合并淋巴细胞甲状腺炎。据报道，FNA 细胞学诊断假阴性发生率为 0%~14%^[31-32]，其可能原因有穿刺时没有准确穿刺到阳性结节或者患者新发生的恶性结节^[33]。推测本研究中 2 例假阴性结果可能与结节偏小（2 例结节大小分别为 4.3 mm× 3.6 mm×3.4 mm 和 5.1 mm×3.5 mm×5.3 mm）和合并桥本有关。在结节体积偏小时往往可能造成穿刺样本不能代表微小结节。在穿刺过程中需要将穿刺针来回往复，若结节太小则可能连带到结节周围正常组织，造成假阴性（本研究所使用穿刺针的针尖斜面部分长度约3 mm，结节最短径如在3 mm左右，针尖往复的过程中势必可能超出结节范围）。关于穿刺结节大小，美国等国家建议至少在1 cm 以上^[4]，其中很重要的原因也是结节在1 cm以上时，穿刺的可靠性才有保证，太小的结节存在一定的假阴性风险。另外在合并桥本等炎症状态时，容易造成细胞形态异型性，也是可能造成误判的原因。 BRAF^V600E在这样的情况下显示良好的特异性。由此提示对于比较小的甲状腺结节，若超声下形态高度可疑，同时患者比较焦虑，建议可以在穿刺时进行 BRAF^V600E 检测从而能够弥补细胞学假阴性的风险，但是一般建议结节的最短直径至少为5~6 mm^[15]。由于本研究纳入的细胞学诊断为良性结节数量明显偏少，对于SurePath-LBC检测在良性结节中的诊断价值还有待扩大样本量后进一步研究分析。

AUS 是 Bethesda 细胞分类中的不确定类型，对于该类的处理一般建议可以再次FNA、进行分子标志物检测或甲状腺腺叶切除^[20]。本研究中共有23例诊断为AUS，该类别恶性度为87%，明显高于国际报道水平，推测与本研究患者的选择性偏倚有关，可能与这些患者超声提示更高的级别或者BRAF基因检测提示有更高的恶性风险有关。从超声级别来看这23例结节中有19例TI-RADS在4B以上，16例进行了 BRAF^V600E 突变检测。提示对于 AUS 类别结合高危超声特征和 BRAF^V600E 检测可提高术前诊断率，与本研究中心前期研究结果一致^[34]。对于合并有高危特征（如TI-RADS 4B以上，或BRAF^V600E 阳性者）若细胞学诊断为 AUS，可以考虑建议患者手术治疗。后续本研究将进一步扩大 AUS 组患者样本量，研究 SurePath-LBC 联合 BRAF 基因检测诊断良恶性的效能。

本研究尚有10例术前细胞学诊断为ND。一般认为造成 ND 的原因有结节内的囊性成分、血流丰富、钙化以及穿刺固有的缺陷等因素。美国哈佛医学院的研究提示，对于>1 cm实质性结节，FNA仍然有8%左右的无诊断率^[35]。本研究共计363个结节， ND比例占2.8%，虽然是高度选择的样本，总体而言 ND 的比例在可接受范围内。7 例进行了 BRAF^V600E 突变检测，其中4例突变病例均证实为PTC；野生型 3例，2例为良性，1例手术病理为mPTC（甲状腺肿囊性变，中央示隐灶型乳头状癌，直径<2 mm）。对于细胞学诊断为 ND 的结节，笔者建议可再次行 FNA或者联合BRAF^V600E 检测，对于BRAF^V600E 阳性患者，可考虑外科手术治疗。

本研究尚存在明显的局限性。本研究收集的是2019年全年甲状腺外科行甲状腺手术患者的病例资料，临床上许多细胞学诊断提示 Bethesda Ⅰ~Ⅳ类的甲状腺结节患者更倾向于定期随访，而非手术治疗，因此本研究存在明显的选择性偏倚，体现在细胞学诊断为SM和M的患者比例较高，而Ⅰ~Ⅳ 类（ND、B、AUS 和 F）的比例明显偏少，尚需后续扩大样本（尤其是前4类结节）进一步分析。

本研究提示SurePath-LBC病理学诊断与最终手术病理诊断呈现高度一致，诊断为 SM 和 M 与组织病理的吻合度大于97%，同时对于肿瘤类型尤其是恶性度相对较高的MTC 也有很好的提示作用。细胞学诊断为 B、AUS 和 ND 应结合超声特征、 BRAF^V600E突变状态和结节大小等因素综合判定。总体而言，该技术对于甲状腺结节术前诊断具有非常重要的参考价值，值得进一步推广和应用。

参考文献