环磷酰胺是一种常用的治疗实体癌症和血液系统恶性肿瘤的化疗药物，包括乳腺癌、骨癌、软组织肉瘤、霍奇金淋巴瘤、非霍奇金淋巴瘤和白血病^[1]，也是系统性红斑狼疮等自身免疫性疾病患者的一线治疗药物^[2]。环磷酰胺是一种烷基化剂，在抗肿瘤治疗同时也会引起一系列的脱靶效应，包括膀胱损害、免疫抑制和与卵巢卵泡衰竭相关的闭经^[3]，它的活性代谢产物具有强烈的促性毒性作用^[4]，对卵巢具有不可逆的细胞毒性^[5]。在现代生活中，肿瘤的发病率在年轻人群中逐渐升高，这使得使用化疗药物的育龄女性其卵巢受损的发生率也越来越高。研究发现，35 岁以下接受化疗的女性中约有30%出现早发性卵巢功能不全，而35岁至 40 岁女性，这一比例升至 50%^[6]。先前研究表明，化疗药物，特别是烷基化药物如环磷酰胺的使用，会导致原始和窦前卵泡的消耗^[7]，引起卵巢早衰^[8]。尽管有相应的临床措施，比如生育力保存技术可以使接受化疗药物治疗的患者有几率保存一定的生育能力，但其冻卵复苏后的功能恢复效果尚不能完全确定^[9]，因此探索4-羟基过氧环磷酰胺 （4-Hydroperoxy cyclophosphamide，4-HC）诱导细胞损伤的机制，特别是在卵巢颗粒细胞中的作用机制，对于探索减少临床治疗策略的不良反应以及研制新的防治方法至关重要。

卵巢颗粒细胞对外界损伤（如化疗药物）高度敏感，是环磷酰胺诱导卵巢毒性的重要靶点^[10]。研究表明，环磷酰胺化疗显著诱导颗粒细胞凋亡^[11]，并通过减少非静息颗粒细胞产生的性激素含量导致卵巢卵泡闭锁^[12]，最终损伤卵巢功能。虽然环磷酰胺本身在体外无法发挥相应作用，但其活性代谢产物4-HC能够通过增加氧化应激和细胞凋亡，损伤颗粒细胞功能，进而引发卵巢功能不全^[13]。环磷酰胺还通过激活BAX和线粒体凋亡通路，诱导生长卵泡中颗粒细胞的凋亡^[12]。一项体外研究表明，将小鼠卵巢组织与4-HC共培养96 h后，次级卵泡的颗粒细胞出现显著凋亡^[14]。因此，环磷酰胺及其代谢产物 4-HC严重损害卵巢细胞的正常功能。线粒体是提供能量和维持稳态的重要细胞器，广泛存在于卵母细胞以及颗粒细胞中。近期研究发现，腹腔注射环磷酰胺的小鼠，其卵巢中线粒体自噬相关Pink1和Parkin的表达水平增加，导致线粒体功能受损，并使得卵巢中活性氧水平升高^[15]。然而，4-HC损伤卵巢颗粒细胞的具体机制依然不明确，关于其在卵巢颗粒细胞中对线粒体的影响及相关机制仍需要进一步探索。

此外，肿瘤抑制因子P53是一种多功能蛋白，参与细胞凋亡和自噬，在调节颗粒细胞的凋亡中起重要作用。P53介导的细胞凋亡主要通过调控促凋亡和抗凋亡因子（如BAX，BCL2 通路）实现^[16]。P53基因在大多数人类肿瘤中丢失、突变或失活。因此，在不影响药物的抗癌能力的情况下，P53已成为治疗化疗药物不良反应的理想靶点^[17]。在环磷酰胺诱导的早发性卵巢功能不全（premature ovarian in-sufficiency，POI）模型的小鼠中，颗粒细胞中 P53 的表达水平显著增加^[18]。然而，4-HC对颗粒细胞的损伤机制是否与体内实验中观察到的P53表达水平变化相关仍不清楚。因此，本研究通过使用不同浓度和不同暴露时间的4-HC处理SVOG细胞，建立一个卵巢颗粒细胞体外损伤模型，并初步探索4-HC在人卵巢颗粒细胞线粒体中的作用以及其潜在机制。

1 材料和方法

1.1 材料

卵巢颗粒细胞SVOG细胞系由江苏省人民医院生殖中心实验室赠予。4-HC（MCE公司，美国）；双抗胎牛血清（fetal bovine serum，FBS）（Cell science公司，美国）；1640 细胞培养基（Gibco公司，美国）；二甲基亚砜（dimethyl sulfoxide，DMSO）（Sigma公司，美国）；CCK-8、FastPure 细胞/组织总RNA提取试剂盒 （南京诺维赞公司）；JC-1试剂盒、4%多聚甲醛固定液、封闭液（上海碧云天公司）；戊二醛固定液（北京百瑞极公司）；Anti-Parkin 抗体、Anti-Pink1 抗体、 Anti-P62抗体、Anti-Vinculin抗体、Anti-MDM2抗体， Anti-TOMM2O抗体，Anti-β-actin抗体（Proteintech公司，美国）；Anti-P53抗体（Abcam公司，美国）；Triton X-100（BioFroxx公司，德国）；Dapi-Fluoromount-G抗荧光淬灭封片剂（SouthernBiotech公司，美国）；山羊抗兔 IgG（H+L）二抗 Alexa Fluor^TM 594 标记；山羊抗鼠 IgG（H+L）二抗 Alexa Fluor^TM 488 标记（Thermo 公司，美国）。

1.2 方法

1.2.1 细胞培养和4-HC处理

将 SVOG 细胞接种于含有 1%双抗和 10% FBS 的1640培养基中，置于37℃、5% CO₂的细胞培养箱中培养，每 3 d 更换 1 次培养基。以 DMSO 为溶剂，配制4-HC溶液储存浓度为100 mmol/L并以氮气封闭，置于-80℃储存。将4-HC添加到传代后且细胞贴壁的目标培养液中，使得4-HC最终浓度分别为： 0.2、2.0、10.0 μmol/L，混匀培养 24、48、72 h。以DMSO为溶剂对照组，DMSO最终浓度小于0.1%。

1.2.2 CCK-8法检测SVOG细胞活力

接种细胞至96孔板，终体积为100 μL。12 h后显微镜下观察细胞贴壁情况，并加入相应浓度的 4-HC到孔板中，设置空白对照组（仅有培养基）、对照组、溶剂对照组（DMSO）、实验组（4-HC 浓度为： 0.2、2.0、10.0 μmol/L），每组 3 个复孔。放回培养箱培养24、48、72 h。96孔板中避光加入10 μL CCK-8 工作液，在培养箱中避光孵育 3 h，酶标仪检测 450 nm 处的吸光值。各组吸光度按照下列公式计算：（A-C）/（B-C）×100%（A：实验组或溶剂对照组吸光度值，B：对照组吸光度值，C：空白对照组吸光度值），换算为细胞活力百分比。

1.2.3 JC-1检测线粒体膜电位

细胞在6孔板中贴壁培养24 h后，弃去原始培养基，加入配制好的1 mL JC-1工作溶液，在37℃下孵育 20 min。移除上清液，缓冲液洗涤两次，加入 2 mL培养基，最后在共聚焦显微镜下观察细胞线粒体膜电位。

1.2.4 透射电镜观察线粒体超微结构

收集 SVOG 细胞并以 2.5%戊二醛为固定液室温固定1 h，使用伊红染色，将细胞包裹于琼脂糖中并离心，使SVOG细胞聚集于EP管底。待琼脂糖凝固后再加入戊二醛固定，冰上送至南京医科大学分析测试中心进行后续工作。制样后使用 JEM-1400Flash透射电子显微镜观察结构。

1.2.5 实时荧光定量 PCR（RT-qPCR）检测相关 mRNA的表达

采集样品后，加入 5 μL RNA 保护剂和 340 μL RLT 缓冲液（包含 1%β-巯基乙醇）及 5 μL 载体 RNA，以防总RNA 降解。将样品转移到装有gDNA 吸附柱的2 mL收集管中，在4℃下以12 000 g离心 30 s，弃掉滤柱，保留收集管里的液体。向收集管中加入等体积的350 μL 70%乙醇，并充分混合。将样品和沉淀物一起转移到 RNeasy 离心柱，密封后在 4℃、12 000 g 离心 15 s，移除液体。加入 700 μL RW1 到柱中，再次密封和离心，弃掉液体。加入 500 μL RPE液，重复密封和离心步骤并弃液。随后用 800 μL 80%乙醇清洗离心柱，离心 2 min 后弃掉流出液和收集管。将离心柱放在新的2 mL收集管上，开盖全速离心以干燥，换上1.5 mL无RNA酶管，加入14 μL 超纯水，离心1 min收集RNA，立即冷冻或逆转录。冰上解冻cDNA逆转录试剂盒并进行涡旋和离心，将样本逆转录为cDNA。以GAPDH为内参基因，RT-qPCR 反应体系（20 μL）：2×TB Green Master，Mix 10 μL，cDNA 2 μL，上下游引物（10 μmol/L） 各0.4 μL，无菌蒸馏水7.2 μL。上机，按照程序流程设置温度和时间进行反应。引物序列见表1。

1.2.6 蛋白质印迹实验

SVOG细胞在加入蛋白酶抑制剂的RIPA裂解液中裂解，并在冰上放置30 min。随后离心并收集上清液测定蛋白浓度，将样品在95 °C下变性5~10 min。之后，将 20 μg 蛋白加到 10%或 12%的 SDS-聚丙烯酰胺凝胶中，并以120 V进行电泳1.5 h。分离后的蛋白质随后被转移到硝酸纤维素膜上，之后将膜置于封闭缓冲液（5%脱脂奶粉、0.05% Tween-20， 20 mmol/L Tris缓冲盐溶液，pH 8.0）中，在室温下孵育至少1 h，并在4℃下与一抗过夜孵育。随后与辣根过氧化物酶标记的山羊抗兔或山羊抗鼠二抗孵育1 h，化学发光法检测信号。

1.2.7 免疫荧光法

细胞在4%多聚甲醛中固定15 min，通透细胞膜后并封闭，加入配制好的抗体，在4℃下孵育过夜。次日，细胞爬片与 CoraLite488 标记的山羊抗小鼠 IgG（H+L）和山羊抗兔 IgG 抗体（H+L）在室温下孵育1 h。细胞核使用DAPI进行染色。通过共聚焦显微镜采集信号。

1.3 统计学方法

所有统计学结果均采用 GraphPad Prism 8 进行分析，所有数据均以均数±标准差（$\stackrel{-}{x}\pm s$）表示，两组资料间比较采用独立样本 t 检验，多组资料间比较采用单因素方差分析，P <0.05 为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 建立体外卵巢颗粒细胞4-HC损伤模型

为确定4-HC对卵巢颗粒细胞损伤作用的浓度和暴露时间，本研究检测了不同 4-HC 添加浓度 （0.2、2.0、10.0 μmol/L）在不同暴露时间（24、48、72 h） 下的细胞形态，分为对照组、溶剂对照（DMSO）组、 0.2 μmol/L 4-HC组、2.0 μmol/L 4-HC组、10.0 μmol/L 4-HC组，并采用 CCK-8 法检测细胞活力。显微镜下观察细胞形态，结果显示，对照组、DMSO 组和 0.2 μmol/L 组在 24 h、48 h 以及 72 h 的卵巢颗粒细胞贴壁生长，表面平滑，边界清晰，并无损伤表型； 10.0 μmol/L 组细胞 24 h 后死亡；2.0 μmol/L 组作用 24 h的卵巢颗粒细胞无损伤表型，但是48 h后存在细胞皱缩，结构松散，细胞核变大，部分细胞不贴壁的损伤表型，而 72 h 后细胞老化严重，出现更严重的皱缩和死亡，只有少量细胞存活（图1A）。CCK-8 法观察各组细胞活力结果显示，培养 24 h 后， 0.2 μmol/L组和2.0 μmol/L组与对照组差异无统计学意义，而10.0 μmol/L组细胞无法存活；培养48 h后， 0.2 μmol/L组与对照组无明显差异，而2.0 μmol/L组与对照组有显著差异；培养 72 h 后 0.2 μmol/L 组与对照组无明显差异，2.0 μmol/L 组与对照组有显著差异，且存活率下降至 20%（图1B~D），因此选择 2.0 μmol/L的4-HC体外作用卵巢颗粒细胞48 h诱导损伤模型。

2.2 在4-HC损伤的卵巢颗粒细胞中线粒体自噬受到抑制

探索4-HC损伤卵巢颗粒细胞的机制对于研究减少环磷酰胺临床治疗不良反应并开发新的防治疗手段具有重要意义。线粒体是卵巢中最重要的细胞器。为研究4-HC损伤与线粒体是否相关，使用 JC-1检测线粒体膜电位，分为DMSO组和4-HC组，结果显示，与DMSO 组相比，4-HC 组的线粒体膜电位显著下降（图2A，P <0.05），表明4-HC 可能损伤了SVOG的线粒体功能。利用透射电镜对各组的线粒体超微结构进行观察，结果显示，与 DMSO 组相比，4-HC组的线粒体异常肿胀，线粒体嵴变形且空泡化严重，细胞内受损线粒体明显增多（图2B），表明线粒体受到损伤并提示线粒体自噬可能受到阻碍。进一步对各组的线粒体自噬通量进行检测， RF-qPCR 和 WB 结果显示，与 DMSO 相比，4-HC组的Parkin、Pink1以及P62的mRNA 和蛋白表达均显著性升高（图2C~F，P均<0.001）。因此，4-HC可能抑制了卵巢颗粒细胞中的线粒体自噬，使得受损线粒体增加，阻碍了线粒体的正常功能。

2.3 P53蛋白在4-HC损伤的卵巢颗粒细胞胞质中累积

P53作为调控颗粒细胞凋亡的重要因子，在线粒体自噬中也发挥着不可或缺的作用。为研究4-HC抑制线粒体自噬的机制，检测了各组 P53 的表达水平。免疫荧光结果显示，4-HC组中P53的荧光强度明显增加，且胞质中更为显著（P <0.05），DMSO 组中 P53 低表达，且细胞核中表达较多（图3A）。WB 结果表示，4-HC组中P53的表达水平较DMSO组显著增加；MDM2 是一种通过结合P53并促进其降解的蛋白质，4-HC 组中 MDM2 的表达水平显著降低（图3B、C，P <0.01）。因此，4-HC使P53在卵巢颗粒细胞中累积，而这一现象与4-HC抑制线粒体自噬的关系仍需要进一步探索。

2.4 4-HC 可能通过 P53-Parkin 通路抑制线粒体自噬

4-HC体外损伤卵巢颗粒细胞会使细胞中Parkin 蛋白增加，提示Parkin依赖的线粒体自噬通路可能出现异常。免疫荧光检测 TOMM20 与 Parkin 的表达，与 DMSO 组相比，4-HC 组中 Parkin 蛋白与 TOMM20 蛋白的共定位明显降低（图4A、B）。而 Parkin 蛋白含量增加，提示 Parkin 依赖的线粒体自噬通路受到了阻塞，将 P53 蛋白与 Parkin 蛋白免疫荧光共染色，与 DMSO 相比，4-HC 组中 P53 蛋白明显增加且在胞质中与 Parkin 蛋白共定位明显，而 DMSO组中几乎没有共定位（图4C、D）。因此，在4-HC 体外损伤卵巢颗粒细胞中，P53在胞质中累积，可能竞争性结合胞质 Parkin 蛋白，阻止 Parkin 蛋白向受损的线粒体移位，从而抑制了线粒体自噬。

3 讨论

在现代社会，年轻人肿瘤的发病率逐渐上升，这导致育龄女性在接受化疗时卵巢功能受到不同程度的损害。环磷酰胺作为临床常用的化疗药物，是损伤女性癌症治疗患者卵巢功能的主要原因之一。目前，在临床中，缺乏减轻环磷酰胺导致女性生育能力受损的有效治疗方法^[19]。因此研究环磷酰胺损伤卵巢的潜在作用机制对于研制出有效的临床治疗应对策略或者预防方法至关重要。本研究探讨了环磷酰胺的体外活化物4-HC对人卵巢颗粒细胞系SVOG的功能损伤及其可能机制，发现4-HC对SVOG细胞产生显著的损伤作用，并伴随线粒体自噬通量的抑制，这一结果提示4-HC可能通过影响细胞内的自噬途径导致线粒体功能障碍。

本研究发现，4-HC在一定浓度范围内对细胞具有显著的毒性作用，且2.0 μmol/L的4-HC处理SVOG 细胞48 h能够有效地构建体外损伤模型，模拟卵巢颗粒细胞的损伤状态。先前研究显示^[20]，当分离的卵巢暴露于 4-HC（20 μmol/L）时，卵泡存活率和卵母细胞成熟率均显著降低，这可能由于卵巢中微环境的存在，减轻了 4-HC 的毒性作用，使得 4-HC 的损伤浓度阈值增加。

卵巢颗粒细胞是包裹在卵母细胞表面的细胞，在卵泡发育和卵母细胞成熟中起着重要作用^[21]。先前的一项研究表明，当雌性动物接受化疗时，卵巢颗粒细胞会通过细胞凋亡相关信号通路丢失损伤，在体内外添加环磷酰胺以及其活化物4-HC都会损害腔前卵泡^[22]。从小鼠中分离卵巢组织，在体外用4-HC培养96 h后发现4-HC损伤了次级卵泡的颗粒细胞的凋亡^[14]。过去研究多集中于利用干细胞治疗化疗损伤的卵巢颗粒细胞凋亡，来自人多能干细胞-间充质干细胞的外泌体能够抑制环磷酰胺诱导的细胞凋亡^[23]。然而，干细胞在临床应用中存在诸多限制，难以广泛使用。不可避免的挑战包括自体组织来源不足、细胞移植成功率低、潜在的致瘤风险以及免疫排斥以及高昂的费用等问题，导致其可行性仍然受到限制^[24]。

透射电子显微镜的结果显示4-HC损伤的颗粒细胞线粒体形态严重受损并出现空泡化，受损线粒体数量明显增加且膜电位紊乱。4-HC诱导的颗粒细胞线粒体功能异常伴随着线粒体自噬通路的阻塞。通过免疫荧光和WB分析结果显示P53在胞质中累积，并阻碍依赖Parkin的线粒体自噬通路。P53 作为一种关键的细胞周期调控蛋白，广泛参与细胞的应激反应、DNA损伤修复和细胞凋亡。已有研究表明，P53不仅调控细胞凋亡，还参与自噬的调控。本研究中P53表达的增加可能通过与Parkin的相互作用，抑制了受损线粒体的自噬，进而导致线粒体的积累和功能异常。表明 4-HC 可能是通过调控 P53-Parkin通路影响线粒体自噬，进而对卵巢颗粒细胞产生毒性作用。研究显示，Parkin介导的线粒体自噬抑制是阿霉素引起的心脏毒性致病性改变的主要原因之一^[25]，阿霉素作为一种抗肿瘤药物，会导致心肌细胞损伤，包括线粒体障碍并引起氧化应激。

本研究揭示了 4-HC 通过 P53-Parkin 通路抑制线粒体自噬的潜在机制，为理解卵巢颗粒细胞的损伤机制提供了重要的理论依据。线粒体自噬在维持细胞稳态和功能中起着至关重要的作用，4-HC引发的线粒体自噬抑制可能是SVOG细胞功能障碍的关键原因之一。因此，靶向调控P53-Parkin通路可能成为预防或缓解4-HC引发的卵巢颗粒细胞损伤的潜在策略。然而，本研究存在一些局限性。首先，实验主要基于体外模型，未来需要通过体内实验进一步验证在实际生理病理环境中的适用性。体内药物的代谢动力学与分布受诸多因素影响，如肝肾功能、酶活性、药物相互作用等，这可能导致血液或组织中的药物浓度与实验设定的浓度存在差异。因此，实验结果的临床应用仍有待验证。其次，P53 和 Parkin 之间的相互作用机制仍需进一步研究，以明确其具体的调控网络和信号通路。

综上所述，本研究表明 4-HC 可能通过 P53-Parkin 通路抑制线粒体自噬，进而导致 SVOG 细胞的功能损伤。这一发现为深入理解环磷酰胺诱导卵巢颗粒细胞损伤的机制提供了新见解，也为预防化疗导致的卵巢损伤的提供了潜在靶点。

参考文献