胶质瘤是一类起源于神经胶质细胞的肿瘤，是中枢神经系统最常见的原发性肿瘤，约占恶性肿瘤的80%。根据病理类型和恶性程度，胶质瘤可分为 Ⅰ~Ⅳ级，其中Ⅳ级是最具有侵袭性的类型。胶质瘤具有强大的增殖和浸润性生长能力，通常会侵犯多个脑叶，甚至扩展到深层脑结构，还可通过胼胝体波及对侧大脑半球。额叶是胶质瘤最常见的发病部位。目前，临床上治疗胶质瘤的方法主要包括手术、放疗、化疗、肿瘤电场治疗及其他综合治疗。然而，由于其恶性程度高，且易转移复发，胶质瘤患者的预后普遍较差。因此，迫切需要找到有效的分子靶点，以延长患者生存期并改善预后^[1-3]。

无菌α基序结构域蛋白（sterile alpha motif do-main-containing protein，SAMD）家族是一类包含有无菌α基序（sterile alpha motif，SAM）结构域的蛋白质家族。SAM 结构域是一种高度保守的蛋白质相互作用模块，广泛存在于多种真核生物蛋白质中，参与多种细胞功能，如信号转导、细胞周期调控、细胞凋亡等。近些年来，SAMD家族在肿瘤进展中，尤其是在介导肿瘤细胞增殖和侵袭方面的作用备受关注。例如，在肝癌细胞中SAMD1缺失会导致细胞增殖能力显著下调^[4]。在小细胞肺癌和前列腺癌细胞中，SAMD5的表达显著上调，并与肿瘤细胞的增殖和患者预后相关^[5-6]。在胶质瘤中存在SAMD9的高表达，PARP14可以通过诱导SAMD9表达，促进胶质瘤细胞增殖^[7]。此外，SAMD12的表达与骨肉瘤的进展有一定关系，研究发现SAMD12的耗竭会损害多种骨肉瘤细胞的侵袭能力^[8]。然而 SAMD 家族中 SAMD13研究较少，虽然有文献报道SAMD13表达与肝细胞癌患者的预后显著相关^[9]，但目前尚不清楚其是否可以调控肿瘤细胞的增殖和侵袭。

一些信号分子和转录因子，如Akt丝氨酸/苏氨酸激酶 1（Akt serine/threonine kinase1，Akt1）、细胞外信号调节激酶1/2（extracellular signal-regulated ki-nases 1/2，ERK1/2）和信号转导和转录激活因子 3 （signal transducer and activator of transcription 3， STAT3）的磷酸化激活也与包括胶质瘤在内的多种肿瘤细胞的增殖和侵袭密切相关^[10-15]，但是 SAMD13能否调控上述分子的磷酸化修饰，目前尚不清楚。因此，本研究检测胶质瘤组织和多种细胞系中 SAMD13 的表达情况，开展 SAMD13 基因的过表达和沉默实验，研究SAMD13对于胶质瘤细胞增殖和侵袭的影响，并进一步探究SAMD13对于Akt1、 ERK1/2和STAT3活性的调控作用，筛选SAMD13下游的重要靶分子。

1 材料和方法

1.1 材料

总Akt1（t-Akt1）、磷酸化Akt1（p-Akt1，Ser473）、总 ERK1/2（t-ERK1/2）、磷酸化 ERK1/2（p-ERK1/2， Thr202/Tyr204）、总 STAT3（t-STAT3）和磷酸化 STAT3（p-STAT3，Tyr705）抗体（Cell Signaling Tech-nology 公司，美国）；SAMD13 抗体（Abcepta 公司，美国）；β-actin抗体和HRP标记山羊抗兔和山羊抗鼠二抗（武汉 ABclonal 公司）；CCK-8 试剂盒和 U0126 （ERK1/2 抑制剂）（上海 MCE 公司）；人胶质瘤细胞系（U87、U373 和 U251）购自上海细胞库；胎牛血清 （fetal bovine serum，FBS）（Wisent 公司，加拿大）； DMEM 培养基（Gbico 公司，美国）；Lipofectamine2000（Thermo Fisher Scientific 公司，美国）；RIPA 裂解液（上海碧云天生物科技有限公司）；RNA提取试剂（VeZol）、逆转录试剂盒、PCR试剂盒和ECL化学发光试剂盒（南京诺唯赞生物科技有限公司）；Tran-swell小室（Corning公司，美国）。

1.2 方法

1.2.1 数据库分析

使用基于基因表达水平值的交互式分析平台 （gene expression profiling interactive analysis，GEPIA）数据库（http：//gepia.cancer-pku.cn/）分析低级别胶质瘤（low-grade glioma，LGG）和高级别胶质瘤——胶质母细胞瘤（glioblastma multiforme，GBM）患者肿瘤组织中 SAMD13 基因的表达情况，并分析 SAMD13 基因表达与胶质瘤患者预后的相关性。

1.2.2 细胞培养

将 U373、U87 和 U251 细胞接种于 3 mL 含 10% FBS的DMEM 完全培养基中，置于37℃、5% CO₂培养箱中培养。细胞传代：当细胞融合度为90%左右时，用 1 mL 0.25%胰蛋白酶消化细胞，3 mL 完全培养基终止消化，1 000 r/min离心5 min后重悬细胞，按1∶3比例接种于新的细胞培养皿，置于培养箱中继续培养。

1.2.3 质粒构建

SAMD13过表达质粒委托通用生物（安徽）股份有限公司构建，以 pIRES2-EGFP 质粒作为载体，构建 SAMD13 过表达质粒，并命名为 pIRES2-SAMD13。由南京科瑞斯生物科技有限公司设计并合成 3 个针对 SAMD13 基因不同靶点的 shRNA 序列，并以pRNA3-SV40-GFP（2A）Puro-U6质粒作为载体，构建各shRNA表达质粒，分别命名为shSAMD13-1 （5′-GCTATCTGTTGACATGGAA-3′）、shSAMD13-2 （5′-GGATTTGAGGAGCAAGCTA-3′）、shSAMD13-3 （5′-TGCTATTGATGACAAGAAA-3′），同时合成对照 shRNA（shCTR，5′-TTCTCCGAACGTGTCACGT-3′）。

1.2.4 细胞转染

取 6 μL Lipofectamine2000 和 94 μL 无血清 DMEM，吹打混匀；另取 2 μg 质粒加入 100 μL 无血清DMEM，吹打混匀；将稀释后的Lipofectamine2000 加入稀释后的质粒中，吹打混匀，静置15 min；弃掉细胞培养皿中的DMEM，用PBS清洗，加入1.8 mL无血清DMEM，将静置后的Lipofectamine2000和质粒混合溶液加入细胞培养皿中，培养8 h后，换含10% FBS的DMEM培养基继续培养。

1.2.5 RT-PCR

通过NCBI数据库查找人SAMD13和GAPDH基因mRNA序列，并使用Primer-BLAST在线设计PCR 引物，由通用生物（安徽）股份有限公司合成。引物序列如下：SAMD13（上游 5′-GTGCTTTTCAGGAA-CAGGAAAT-3′；下游 5′-CCTTTGTGGGGAGGAGT-GTC-3′）；GAPDH（上游 5′-GCGTCGCCAGCCGAG-3′；下游 5′-TGGAATTTGCCATGGGTGGA-3′）。用 VeZol裂解细胞，提取细胞总RNA，再用 HiScript Ⅱ QRT SuperMix 逆转录为 cDNA，以 cDNA为模板，用2 ×Taq Plus Master Mix Ⅱ进行PCR扩增反应，PCR产物用1.5%的琼脂糖凝胶进行电泳（120 V，30 min），进行琼脂糖凝胶成像观察。

1.2.6 Western blot检测

用 RIPA 裂解细胞，将细胞裂解物煮沸后离心 （12 000 g，5 min）取上清，用10%或12%预制混胶行 SDS-PAGE电泳，先用50 V恒压电泳30 min浓缩蛋白，再用120 V恒压电泳2 h分离蛋白，接着用0.3A 湿转2 h，待蛋白转印到PVDF膜上后，再用5%脱脂奶粉室温封闭 2 h，加入 SAMD13（1∶1 000）、t-Akt1 （1∶1 000）、p-Akt1（1∶1 000）、t-ERK1/2（1∶1 000）、 p-ERK1/2（1∶2 000）、t-STAT3（1∶1 000）、p-STAT3 （1∶2 000）和β-actin（1∶100 000）抗体，4℃孵育过夜，用1×TBST洗涤3次，每次15 min，再用HRP标记的二抗（1∶10 000）室温孵育 40 min，洗涤 3 次后行 ECL化学发光试剂检测。

1.2.7 CCK-8实验

将U373细胞接种于96孔板，同时转染各shRNA，培养48 h，用无血清DMEM配制10%的CCK-8工作液，每孔替换100 μL CCK-8工作液，放置培养箱孵育，用酶标仪测定在450 nm的吸光度值。

1.2.8 侵袭实验

将 U373 细胞接种于 Transwell 小室，24 孔板下室加入 600 μL DMEM，放置细胞培养箱中，12 h 后弃上清，用 PBS 洗涤 Transwell 小室 3 次，之后将 Transwell 小室放入甲醇中固定 30 min，再用 PBS 次洗涤3次，接着加入结晶紫染色30 min，用PBS洗涤 3次。擦去Transwell 小室内部未穿膜的细胞，自然干燥，在显微镜下观察并拍照。

1.3 统计学方法

所有实验均独立重复3次，所得定量数据以均数±标准误（$\stackrel{-}{x}\pm S_{\stackrel{-}{x}}$）表示。采用 SPSS 19.0 统计软件进行统计学分析，两组间比较采用配对t检验，多组间比较则采用单因素方差分析，Bonfferoni法进行两两比较，P <0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 胶质瘤患者肿瘤组织和细胞系中 SAMD13 的表达情况

首先使用 GEPIA 数据库分析胶质瘤患者肿瘤组织中SAMD13的表达情况，结果发现与癌旁正常组织比较，SAMD13在患者肿瘤组织中显著高表达 （图1A），且GBM组织中SAMD13表达量多于LGG，并与患者的不良预后密切相关（图1B）。之后，选用U373、U87和U251 3种人胶质瘤细胞系，通过RT-PCR 和 Western blot 实验发现这 3 种细胞系均表达 SAMD13（图1C、D），其中以 U373 细胞的表达量最高，故后续拟选用U373细胞开展相应体外实验。

2.2 SAMD13过表达和小干扰质粒的构建与鉴定

以 pIRES2-EGFP 质粒为载体，构建人 SAMD13 基因过表达质粒（pIRES2-SAMD13）。将 pIRES2-EGFP和pIRES2-SAMD13质粒转染U373细胞48 h，行 Western blot 检测 SAMD13 的表达水平，结果表明，与pIRES2-EGFP质粒转染组相比，转染pIRES2-SAMD13 质粒后 U373 细胞中 SAMD13 的表达显著上调（图2A）。设计并合成针对人 SAMD13 基因的 3 个不同靶点的 shRNA 质粒（shSAMD13-1、 shSAMD13-2、shSAMD13-3）和对照 shRNA 质粒 （shCTR），将上述质粒分别转染 U373 细胞，进行靶点筛选。Western blot 检查发现，shSAMD13-1 降低 SAMD13 蛋白表达的能力最强（图2B），故后续采用shSAMD13-1进行实验，并简称为shSAMD13。

2.3 过表达 SAMD13 基因促进胶质瘤细胞增殖和侵袭

将 pIRES2-EGFP 和 pIRES2-SAMD13 质粒分别转染U373细胞48 h，行CCK-8检测细胞增殖能力，结果表明，与 pIRES2-EGFP 质粒转染组相比，转染 pIRES2-SAMD13质粒后U373细胞的增殖能力明显增加（图3A）。同时，开展Transwell实验发现，转染 pIRES2-SAMD13 质粒后，Transwell 膜上富集的细胞数明显多于 pIRES2-EGFP 质粒转染组（图3B）。提示，过表达 SAMD13 后 U373 细胞的侵袭能力明显增强。

2.4 沉默SAMD13基因抑制胶质瘤细胞增殖和侵袭

将 shCTR 和 shSAMD13 质粒分别转染 U373 细胞，并于48 h后行CCK-8检测细胞增殖能力，结果发现，与shCTR质粒转染组相比，转染shSAMD13质粒后U373细胞的增殖能力明显下降（图4A），同时，进行了 Transwell 实验，发现转染 shSAMD13 质粒后， U373细胞的侵袭能力明显弱于shCTR 质粒转染组 （图4B）。

2.5 过表达和沉默SAMD13对胶质瘤细胞中Akt1、 ERK1/2和STAT3磷酸化的影响

为了进一步探究 SAMD13 调控 U373 细胞增殖和侵袭的机制，在 U373 细胞中分别转染 pIRES2-EGFP 和 pIRES2-SAMD13 质粒，检查了一些信号分子或转录因子（Akt1、ERK1/2和STAT3）的表达和磷酸化修饰，发现通过转染pIRES2-SAMD13质粒过表达SAMD13后，可显著增强ERK1/2的磷酸化，而对 Akt1和STAT3的磷酸化无明显影响（图5A）。此外，在U373细胞中转染shCTR和shSAMD13质粒，结果表明，通过转染shSAMD13质粒沉默SAMD13后，可显著减弱 ERK1/2 的磷酸化，而对 Akt1 和 STAT3 的磷酸化也无明显影响（图5B）。

2.6 SAMD13通过增强ERK1/2磷酸化促进胶质瘤细胞增殖和侵袭

为了进一步探究SAMD13通过ERK1/2对U373 细胞增殖和侵袭的调控作用，将 pIRES2-EGFP 和 pIRES2-SAMD13 质粒转染 U373 细胞，同时给予 ERK1/2抑制剂U0126（设DMSO溶剂对照组），分别开展了 Western blot、CCK-8 和 Transwell 实验，检查 ERK1/2磷酸化、细胞增殖和侵袭。结果表明，转染 pIRES2-SAMD13 后，可显著增强 SAMD13 表达和 ERK1/2 磷酸化（图6A），并促进细胞增殖（图6B） 和侵袭（图6C），而在转染 pIRES2-SAMD13 质粒后加入 U0126 处理细胞，ERK1/2 的磷酸化（图6A）、细胞增殖（图6B）和侵袭（图6C）均明显减弱，但对 SAMD13 表达无显著影响（图6A）。提示 SAMD13 通过增强 ERK1/2 磷酸化促进胶质瘤细胞增殖和侵袭。

3 讨论

SAMD13 在多种器官和细胞中广泛表达，如甲状腺细胞、心肌细胞、子宫内膜基质细胞和胃肠道细胞等，但其具体的生物学功能仍不明确。通过 GEPIA 数据库分析发现，胶质瘤患者肿瘤组织中 SAMD13的表达明显上调，且随着胶质瘤恶性程度的增加，其表达量也相应升高，同时，SAMD13的高表达与患者的不良预后相关，这表明SAMD13可能在胶质瘤的发生与发展中发挥重要作用。然而， SAMD13在胶质瘤细胞增殖和侵袭中的作用与调控机制尚未有详细研究报道。对此，本研究开展了体外实验，检测了U373、U87和U251 3种胶质瘤细胞系中的SAMD13表达，结果显示，SAMD13在这3种细胞系中均表达，并且以 U373 细胞中表达最为显著，因此，本研究使用U373细胞进一步探索。功能实验结果表明，过表达SAMD13基因可明显增强胶质瘤细胞的增殖和侵袭，而沉默SAMD13基因后，胶质瘤细胞的增殖能力和侵袭能力均明显降低，提示 SAMD13表达可正向调控胶质瘤细胞的增殖和侵袭等生物学行为。

研究发现，一些信号分子和转录因子（如Akt1、 ERK1/2和STAT3）的磷酸化激活与胶质瘤细胞的增殖和侵袭密切相关^[11-13，15]，而SAMD家族成员也可通过调节信号通路的活化来促进肿瘤的进展^[16-19]。有研究表明，SAMD9可以调节MYH9/GSK3β/β-catenin 通路的活化，最终促进食管鳞状细胞癌细胞的干性、上皮间充质转化和转移^[16]。在宫颈癌细胞中， circSAMD11 高表达，能够通过调节 miR-503/SOX4 和激活Wnt/β-catenin通路促进细胞增殖、侵袭和迁移^[17]。SAMD11也参与胃癌细胞中的信号转导，有报道称，与正常组织相比，SAMD12-AS1在人胃癌组织和细胞系中高度上调，上调的SAMD12-AS1主要通过抑制 p53 信号通路来增强细胞的增殖能力^[18]。又有学者发现，lncRNA SAMD12-AS1过表达促进肝癌细胞的增殖和侵袭，其机制涉及lncRNA SAMD12-AS1 过表达促进 p53 信号通路的活化，导致细胞发生上皮间质转化，最终介导肝癌的恶化^[19]。但迄今为止，关于胶质瘤细胞中SAMD13高表达对细胞内信号分子和转录因子活性的调控，尚未见文献报道。据此，本研究选取了一些与肿瘤细胞增殖和侵袭密切相关的信号分子和转录因子，如Akt1、ERK1/2 和 STAT3，探究了 SAMD13 过表达和沉默对于上述蛋白磷酸化修饰的调控效应，结果表明，在胶质瘤细胞中过表达或沉默SAMD13可分别显著增强或减弱 ERK1/2 的磷酸化，而对 Akt1 和 STAT3 的磷酸化无明显影响。此外，ERK1/2抑制剂U0126可显著抑制由SAMD13过表达所上调的胶质瘤细胞的增殖和侵袭。提示SAMD13-ERK1/2通路在胶质瘤细胞增殖和侵袭中可能发挥了重要的促进作用。关于 SAMD家族其他成员可否调控ERK1/2的磷酸化，目前也尚未见文献报道。故本研究结果或许能为探索SAMD家族的功能提供新的思路。

ERK1/2是细胞内重要的信号分子，在多种上游因素的作用下，ERK1/2 的 Thr202 和 Tyr204 位点发生磷酸化修饰，从而导致 ERK1/2 的活化，进而激活下游多种底物蛋白，促进细胞的增殖、分化和侵袭^[20-21]。本研究揭示 SAMD13 可诱导 ERK1/2 的 Thr202和Tyr204位点发生磷酸化修饰，从而促进胶质瘤细胞增殖和侵袭，而关于 SAMD13 如何激活 ERK1/2，有待进一步的探索。

综上所述，本研究表明，胶质瘤患者癌组织和胶质瘤细胞系中均高表达 SAMD13；胶质瘤细胞中高表达的SAMD13可促进ERK1/2的磷酸化，进而增强胶质瘤细胞的增殖和侵袭能力。本研究为进一步探究胶质瘤的发病机制和潜在干预靶点提供了实验依据。

参考文献