缺血再灌注损伤（ischemia-reperfusion injury， IRI）可发生在多种组织器官中，包括脑、肾脏、心脏、肝脏、肢体等^[1]。缺血再灌注早期，相关免疫细胞尤其是巨噬细胞被激活，释放多种炎症因子、化学分子、活性氧（reactive oxygen species，ROS），从而引起缺血再灌注后期中性粒细胞的浸润和细胞的凋亡，导致组织坏死^[2]。目前IRI过程中免疫细胞参与的机制仍不明确。多种微小RNA（microRNA，miRNA） 被证明参与免疫反应，特别地，miRNA-146a（miR-146a）被证实通过靶向抑制肿瘤坏死因子受体相关因子6（tumor necrosis factor receptor-associated factor 6，TRAF6），可负性调节 Toll 样受体 4（Toll-like receptor 4，TLR4）通路^[3]。然而，miR-146a能否通过抑制TLR4信号通路，减轻IRI还有待深入研究。本研究通过建立体外巨噬细胞缺氧-复氧模型模拟缺血再灌注过程，并通过定量PCR及蛋白印迹实验研究此过程中 miR-146a 的表达水平，以及 TRAF6 mRNA和蛋白的表达水平，并通过转染miR-146a模拟物（miR-146a mimic）及抑制物（miR-146a inhibitor），验证其对 TRAF6 的调控以及对巨噬细胞炎症因子和ROS 释放的调节作用，为减轻组织器官IRI 提供新的方向和治疗策略。

1 材料和方法

1.1 材料

小鼠巨噬细胞系RAW264.7购于中国科学院上海细胞资源中心。

胎牛血清、DMEM培养基、无糖DMEM培养基、 0.25%胰酶（Gibco 公司，美国）；AnaeroPack-Anaero 缺氧袋（MGC公司，日本）；TRAF6及β-actin的引物、 TRIzol、Lipofectamine2000（Invitrogen 公司，美国）； Taqman^TM MicroRNA 反转录试剂盒、miR-146a 及 RNU6B 特异性 Taqman 探针和 Taqman^TM Universal PCR Master Mix（ABI公司，美国）；TRAF6、β-actin一抗（Santa 公司，美国）；miR-146a mimic、miR-146a inhibitor 以及相应的阴性对照（上海吉玛公司）； Valukine ELISA kit（RD公司，美国）；Dual-Glo luciferase Reporter Assay System（Promega公司，美国）。

1.2 方法

1.2.1 细胞培养

在恒温 37℃、含 5% CO₂的细胞培养箱中进行细胞培养，培养基为添加了10%胎牛血清、50 U/mL 青霉素和50 μg/mL庆大霉素的DMEM培养基。

1.2.2 缺氧-复氧实验

参考Liu等^[4] 报道的细胞缺氧-复氧模型，取对数生长期的 RAW264.7 细胞系，每孔 4×10⁵ 个细胞种植于 6 孔板中培养 24 h，换成无血清无糖培养基，置于 AnaeroPack-Anaero 缺氧袋内，通过氧指示剂显示袋内氧含量低于 5%时再培养 1 h，拿出并换成完全培养基继续培养 6 h 后收集细胞及细胞上清液。

1.2.3 细胞转染

取对数生长期的RAW264.7细胞系，每孔4×10⁵ 个细胞种植于 6 孔板中培养 24 h，50 nmol/L miR-146a mimic 或 miR-146a inhibitor，以及相应的阴性对照通过 Lipofectamine2000 进行转染，具体转染步骤参照试剂盒说明书，转染后24 h收集标本或进行缺氧-复氧实验。

1.2.4 实时定量PCR

应用TRIzol提取细胞总RNA，并测定RNA浓度及纯度。然后通过反转录试剂盒将总RNA逆转录成cDNA，设计引物序列，TRAF6上游引物：5′-CCT-GGGTTATGTGCCGCTT-3′，下游引物：5′-GAGGAT-GTGAACGAGGTCAGC-3′；β-actin上游引物：5′-GT-GACGTTGACATCCGTAAAGA-3′，下游引物：5′-GCCGGACTCATCGTACTCC-3′。最后通过 SYBR Green定量PCR试剂盒进行定量检测。

为检测 miR-146a 的表达，首先利用 Taqman^TM MicroRNA 反转录试剂盒进行逆转录，具体操作按说明书进行，然后应用 miRNA 特异性 Taqman 探针和Taqman^TM Universal PCR Master Mix进行miR-146a 的实时定量检测，RNU6B作为内参。所有实时定量反应均在 ABI StepOnePlus real-time PCR system 上进行，每个反应设3个复孔。

1.2.5 Western blot

细胞用含1%蛋白酶抑制剂的细胞裂解液进行裂解，蛋白样品在10% SDS-PAGE中电泳，然后将蛋白转移至PVDF膜，5%脱脂牛奶在室温下封闭1 h，加一抗（anti-TRAF6、anti-β-actin）在4℃过夜，然后在室温下加HRP标记的二抗孵育1 h。常规ECL曝光、扫描成像。

1.2.6 ELISA

收集细胞上清液，按照ELISA试剂盒说明进行操作，检测上清液中肿瘤坏死因子α（tumor necrosis factor α，TNF-α）的含量，实验重复3次。

1.2.7 双荧光素酶报告分析

pmirGLO、pRL-TK 荧光素酶质粒购于美国Pro-mega公司，设计的野生和突变型寡聚核苷酸序列由上海 Invitrogen 公司合成，通过限制性核酸内切酶 NheⅠ、XhoⅠ位点插入 pmirGLO 质粒，构建完成 pmirGLO-TRAF6-wt/mut质粒，构建的质粒测序证实构建成功。为了进行双荧光素酶报告分析，将miR-146a mimic 或其对照和 pmirGLO-TRAF6-wt/mut 质粒、pRL-TK 质粒共同转染进 RAW264.7 细胞中，转染 24 h 后应用 Dual-Glo Luciferase Reporter Assay System在GloMax 20/20 Luminometer上检测。

野生型寡聚核苷酸序列：正义链 5′-CTAGC-GTTCTCATGGTCAGAAGTTCTCATC-3′，反义链5′-TCGAGATGAGAACTTCTGACCATGAGAACG-3′；突变型寡聚核苷酸序列：正义链5′-CTAGCTTCTCAT-GGTCAGACTGGAGACTC-3′，反义链 5′-TCGAGA-GTCTCCAGTCTGACCATGAGAACG-3′（下划线为酶切位点，加粗部分为靶向序列）。

1.2.8 ROS测定

经处理的细胞用无血清的DMEM培养基漂洗3 遍，用5 μmol/L超氧化物阴离子荧光探针（上海碧云天）在 37℃细胞培养箱中孵育 30 min，然后在荧光倒置显微镜下观察，红色荧光标记代表 ROS 的释放。实验重复3次。

1.3 统计学方法

运用SPSS 18.0软件进行统计分析，计量资料以均数±标准差（$\stackrel{-}{x}\pm s$）表示，两组间比较采用 t 检验， P <0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 巨噬细胞系中缺氧-复氧模型的建立

建立细胞缺氧-复氧模型，定量 PCR 显示 RAW264.7 细胞经过 1 h 缺氧和 6 h 再复氧后 miR-146a 的表达明显下降（图1A），而 TRAF6 的表达则明显升高（图1B）。ELISA 检测细胞上清发现炎症因子TNF-α在缺氧-复氧后分泌也明显增加（图1C）。

2.2 miR-146a调控TRAF6的表达

为了验证 miR-146a 对 TRAF6 的表达调控，将 miR-146a mimic 或 miR-146a inhibitor 分别转染入 RAW264.7细胞中。qPCR结果显示，转染miR-146a mimic明显增加了细胞中miR-146a的表达（图2A），而且Western blot结果显示缺氧-复氧后TRAF6的蛋白表达被抑制（图2C）。相反地，miR-146a inhibitor 有效抑制了 miR-146a 的表达（图2B），同时 TRAF6 的蛋白表达明显增加（图2D）。

2.3 miR-146a靶向结合TRAF6

为了进一步确定TRAF6是否是miR-146a的直接靶点，通过 microRNA 靶点预测软件 Target Scan 5.2得到了miR-146a可能结合TRAF6的3′非翻译区 （3′untranslated region，3′UTR），并以此构建了质粒 pmirGLO-TRAF6-wt/mut（图3A）。最后应用双荧光素酶报告分析，发现转染miR-146a mimic明显降低了 pmirGLO-TRAF6-wt 质粒中荧光素酶活性（图3B）。以上结果表明miR-146a在巨噬细胞中直接靶向TRAF6并下调其表达。

2.4 miR-146a减轻巨噬细胞炎症反应

通过 ELISA 检测细胞上清，发现过表达 miR-146a的巨噬细胞缺氧-复氧后炎症因子TNF-α的分泌较对照组明显减少，而转染miR-146a inhibitor 后可以观察到相反的现象（图4A）。同时在检测细胞 ROS时也发现了类似的改变（图4B）。

3 讨论

IRI 是影响组织器官功能维持的关键因素，其病理过程包括免疫系统的激活、ROS 的释放、细胞的凋亡与损伤等^[1]，而其中巨噬细胞被证明参与多种器官的IRI过程^[5]。多项研究表明缺血再灌注可诱导巨噬细胞浸润并释放多种炎症因子，包括白介素-1β、白介素-6、TNF-α以及 ROS 导致器官组织损伤、坏死^[6-8]。miRNA 是一种约 23 个核苷酸的非编码小RNA，通过与信使RNA的3′UTR互补进行转录后调控^[9]。miRNA 被证明参与几乎所有的生物过程，包括细胞增殖、凋亡、分化等，与此同时，大量证据表明 miRNA 也可参与免疫系统的过程^[10-12]。本研究发现miR-146a通过抑制TRAF6的表达，减轻了巨噬细胞缺氧-复氧过程中炎症因子及ROS的释放。

缺氧-复氧实验是常用的体外缺血再灌注模型^[4]。本研究将此模型应用在小鼠巨噬细胞系RAW264.7 上，以检测缺氧-复氧诱导后miR-146a、TRAF6的表达水平以及炎症因子的释放。结果表明，TRAF6的表达明显上调，而且通过ELISA分析发现炎症因子释放也明显增加，然而细胞中miR-146a的表达却明显下调。提示miR-146a/TRAF6在巨噬细胞的炎症反应中可能起到重要作用，这也与之前的研究报道相符合^[13-14]。此外，与野生型小鼠相比，敲除 miR-146a小鼠骨髓来源的巨噬细胞中TRAF6蛋白水平显著增加^[15]。然而，该小鼠是否对IRI更敏感，有待进一步证实。

为了进一步验证miR-146a与TRAF6之间是否存在调控作用，通过转染miR-146a mimic上调巨噬细胞中miR-146a的表达可以抑制TRAF6的蛋白表达，并且双荧光素酶分析结果表明，这种抑制作用是直接靶向的，相反地，抑制miR-146a的表达则增加 TRAF6 的蛋白表达。本研究结果与最近的报道一致，miR-146a可以靶向TRAF6，负调控Toll样受体信号通路^[16-17]。TRAF6是缺血再灌注诱导的细胞质蛋白激酶，磷酸化后促进转录因子 NF-κB 的核转位，从而释放促炎细胞因子，包括TNF-α和IL-6 ^[7，18]。而且，在TRAF6缺陷的巨噬细胞中，Toll样受体信号通路介导的炎症反应明显受损^[19-20]。本研究发现， miR-146a抑制TRAF6后减少了巨噬细胞炎症因子的释放，相反，抑制miR-146a的表达增加了炎症因子的释放。激活Toll样受体信号通路可以明显增加 ROS的产生^[21]，本研究中转染miR-146a mimic的巨噬细胞缺氧-复氧后ROS产生较对照组明显减少，而抑制miR-146a表达后ROS明显增加。这些结果表明miR-146a可能通过下调TRAF6的表达减轻巨噬细胞炎症反应并减少ROS的释放。

参考文献