脑胶质瘤是最为常见的原发性颅内肿瘤，胶质母细胞瘤（glioblastoma，GBM）是级别最高的胶质瘤类型，具有易复发、高致残、生存期短等特点^[1]。经过标准治疗（手术治疗、放疗、替莫唑胺化疗等），整体预后不理想^[2]。GBM患者5年病死率仅次于胰腺癌和肺癌，位列第3位^[3]。因此，深入探究GBM的发生发展机制，寻找新的潜在治疗靶点，改善GBM治疗抵抗是目前亟待解决的重要问题。整合素结合唾液酸蛋白（integrin binding sialoprotein，IBSP）是存在于骨、牙骨质和牙本质中的多功能细胞外基质蛋白，主要参与骨骼相关细胞的组成，包括肥大软骨细胞、成骨细胞等^[4]。近年来，越来越多的证据表明 IBSP 在肿瘤进展中发挥重要作用。数据库分析发现，IBSP在多种肿瘤中表达水平显著增高，如侵袭性乳腺癌、结肠癌、骨肉瘤等^[5]。研究表明，IBSP可通过激活 Fyn/β-catenin 信号通路促进结肠癌进展^[6]。此外，IBSP 还可通过激活 BMP/SMAD 信号通路或协同 miR-19a 促进乳腺癌增殖及骨转移^[7-8]。然而 IBSP 在胶质瘤中的表达、功能及潜在作用的分子机制尚不清楚。本研究探讨了IBSP在GBM样本中的表达水平及其与患者预后的相关性，同时探索了 IBSP对GBM增殖、侵袭、化疗耐药的调控作用及调控机制，为GBM的治疗提供新的潜在靶点。

1 材料和方法

1.1 材料

实验所用细胞（正常星形胶质细胞 NHA 和 GBM 细胞系 U87、LN229、LN18、D54、T98G、U251S、 U251T3rd、N3S、N3T3rd）由本实验室保存。

DMEM 培养液、胎牛血清（Gibco 公司，美国）； Lipofectamine2000 转染试剂（11668030，Thermo Fisher 公司，美国）；CCK-8 试剂盒、细胞裂解液（上海碧云天）；Transwell 小室、Matrigel 基质胶（Coring 公司，美国）；Annexin V-FITC/PI 细胞凋亡检测试剂盒（上海翌圣生物）；IBSP抗体（#5468，Cell Signaling Technology 公司，美国）；p-p65 抗体（82335）、p65 抗体（10745）、GAPDH 抗体（60004）、羊抗鼠二抗 （RGAM001）、羊抗兔二抗（RGAR001）（Proteintech 公司，美国）；IBSP siRNA质粒（干扰序列：5′-GCCU-AUGAAGAUGAGUACA-3′）、IBSP 过表达质粒及 PCR引物由上海吉凯公司合成。

1.2 方法

1.2.1 公共数据库信息检索

本研究所用胶质瘤数据来自 TCGA、CGGA、 Rembrandt、Gravendeel 数据库，单细胞数据下载自 GEO（GSE182109）数据库。

1.2.2 细胞培养

细胞使用含10%胎牛血清、1%青霉素和链霉素的 DMEM 培养液，于 37℃、5% CO₂培养箱中培养，每2~3 d换液或传代，以维持细胞处于对数生长期。

1.2.3 质粒转染

将对数生长期细胞按5×10⁴ 个/孔接种至6孔板中，置于37℃、5% CO₂培养箱中培养。待细胞生长至60%密度时使用Lipofectamine2000按说明书进行质粒转染。取合适的EP管加入1 500 μL（250 μL/孔） Opti-MEM，加入60 μL（10 μL/孔）Lipofectamine 2000 混匀，室温静置 5 min。另取 EP 管加入 250 μL/孔 Opti-MEM，再加入4 μg/孔siRNA轻轻混匀。将Lipo-fectamine 2000 稀释液加入到 siRNA 稀释液中，轻柔混匀，室温静置 30 min。细胞在转染前 1 h 更换新的无双抗无血清培养液。将制备好的 siRNA-Lipofectamine 2000复合物分别加入细胞培养液中，将培养板轻轻摇动使复合物分布均匀。放入37℃、 5% CO₂培养箱培养，并在4~6 h后更换完全培养液， 24~48 h后进行后续实验。

1.2.4 qRT-PCR

TRIzol 提取细胞 RNA，并通过 Nanodrop 2000/ 2000c 分光光度计检测 RNA 浓度。使用 Prime Script RT Master Mix 反转录试剂盒将 RNA 反转录为 cDNA。按 qRT-PCR 反应体系配制反应溶液，包括上下游引物各 1 μL，SYBR Green Master 2 μL， cDNA 1 μL，DEPC水 5 μL；IBSP上游引物：5′-AAGG-GCACCTCGAAGACAAC-3′，下游引物：5′-CCCTCG-TATTCAACGGTGGT-3′；GAPDH上游引物：5′-AGA-CAGCCGCATCTTCTTGT-3′，下游引物：5′-TGATG-GCAACAATGTCCACT-3′。使用 ABI StepOnePlus^TM 实时PCR系统行qRT-PCR检测。

1.2.5 Western blot

使用细胞裂解液裂解细胞提取总蛋白，BCA法测定蛋白浓度。取等量蛋白加入 Loading Buffer 后煮沸，SDS-PAGE分离蛋白，80 V恒压电泳约20 min 后，调整为120 V恒压电泳。电泳完成后转移蛋白至PVDF膜，5%脱脂牛奶摇床室温封闭2 h。TBST 清洗 PVDF 膜，4℃摇床上一抗孵育过夜。TBST 洗 3 次，每次10 min。二抗室温孵育2 h后，TBST洗膜 3次，每次10 min。使用ECL显影液曝光。

1.2.6 CCK-8实验

将对数生长期GBM细胞按每孔2 000个接种至 96孔板中，分别在24、48、72 h按CCK-8试剂盒说明书检测细胞在450 nm处的吸光度。

1.2.7 克隆形成实验

取对数生长期GBM细胞，将细胞按每孔2 000个接种至 6 孔板中培养 2 周，每 3 d 更换新鲜培养液。吸除培养液后PBS清洗3次，甲醇固定30 min，0.1 % 结晶紫染色30 min，PBS洗3次，晾干后进行细胞克隆计数。

1.2.8 Transwell侵袭实验

将Matrigel基质胶与培养液按1∶4比例混合，均匀涂抹至Transwell小室膜上面，37℃培养箱中放置 1 h，待基质胶凝固后，使用无血清培养液将细胞密度调整至 1×10⁵ 个/mL，吸取 100 μL 细胞悬液加至小室中，小室下方孔板中加入 600 μL 完全培养液。37℃培养48 h后取出小室，弃培养液，棉签轻轻擦拭掉基质胶及小室内细胞，PBS洗3次，甲醇固定30 min，0.1%结晶紫染色30 min，PBS洗3次，显微镜下计数细胞。

1.2.9 3D肿瘤球体侵袭实验

将1滴细胞悬浮液（约20 μL，含有约1 000个细胞）置于10 cm培养皿的盖子上，然后将培养皿盖子翻转盖在含有10 mL PBS的培养皿上。将细胞悬液置于培养箱中培养 48 h。使用 1 mol/L NaOH 将含 2%胎牛血清的 DMEM 调至 pH7.5 用于制备胶原蛋白Ⅰ凝胶（PureCol，Inamed 公司，美国），在 96 孔板中加入胶原蛋白Ⅰ凝胶，4℃离心消除气泡。将收获所得的细胞聚集体加入三维胶原蛋白Ⅰ凝胶中。在37℃条件下聚合后，用300 μL含10%胎牛血清的DMEM 覆盖胶原凝胶。将96孔板置于细胞培养箱中培养。24 h 后使用 Leica DMI3000B 显微镜系统观察实验结果。

1.2.10 流式细胞仪检测凋亡

提前将状态良好的细胞接种于 6 cm 培养皿中，待完全贴壁，给予细胞 200 μmol/L 替莫唑胺 （temozolomide，TMZ）处理 24 h，次日吸除培养液， PBS 清洗 3 次，胰酶消化后离心，去上清，PBS 重悬细胞沉淀，细胞计数后调整每管细胞数为1×10⁵ 个， 1 000 r/min 离心5 min，吸除上清，200 μL 1×Binding Buffer重悬细胞。加入5 μL Annexin V-FITC和10 μL PI Staining Solution，轻轻混匀。避光、室温反应10~15 min。加入400 μL 1×Binding Buffer，混匀后放置于冰上，样品在1 h内用流式细胞仪检测。

1.3 统计学方法

使用 GraphPad Prism 9.0 分析数据并制图。定量实验数据采用均数±标准差（$\stackrel{-}{x}\pm s$）表示，使用 Student’s t检验行两组间比较，使用ANOVA单因素方差分析行多组间比较，Kaplan-Meier 绘制生存曲线，Log-rank行生存分析，P <0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 IBSP在GBM组织和细胞系中表达水平增高

Rembrandt和Gravendeel数据库分析发现，IBSP 在GBM中表达水平显著高于正常脑组织（P <0.01，图1A）。进一步通过PCR及Western blot检测发现， IBSP在GBM细胞系中表达水平显著高于正常星形细胞（P <0.01，图1B、C）。利用胶质瘤单细胞数据集 （GSE182109）分析发现，IBSP在GBM中表达水平显著高于星形细胞瘤、少突胶质细胞瘤（P <0.01，图1D）。TCGA、CGGA、Rembrandt 和 Gravendeel 数据库分析结果表明，IBSP表达水平随GBM级别增高而增高（P <0.01，图1E）。上述结果提示，IBSP可能作为癌基因促GBM恶性进展。

2.2 IBSP表达水平增高与GBM预后不良相关

收集 CGGA、Rembrandt 和 Gravendeel 数据库 GBM 患者预后数据，按 IBSP 表达量中位数将 GBM 患者分为高表达和低表达两组，Kaplan-Meier 生存分析结果提示，IBSP高表达与GBM患者预后较差显著相关（P <0.01，图2A~C）。进一步利用 TCGA 数据库行单因素 Logistic 回归分析发现，IBSP 是 GBM 的独立危险因素（P <0.01，图2D）。

2.3 IBSP促进GBM细胞增殖和侵袭

为明确 IBSP 对 GBM 细胞恶性表型调控作用，分别在 U87 和 LN229 细胞中敲低 IBSP。Western blot结果显示，与对照细胞相比，敲低组细胞中IBSP 表达水平显著降低（图3A）。CCK-8结果表明，敲低 IBSP 可短时间显著抑制 U87 和 LN229 细胞增殖 （P <0.01，图3B）。同时，克隆形成实验结果表明，敲低IBSP可在较长时间内抑制GBM细胞增殖（P <0.01，图3C）。Transwell实验发现，敲低IBSP显著降低GBM细胞侵袭能力（P <0.01，图3D）。3D肿瘤球体侵袭实验进一步证实，敲低 IBSP 抑制 GBM 侵袭能力（P <0.01，图3E）。上述结果表明，IBSP对维持 GBM细胞增殖和侵袭能力至关重要。

2.4 IBSP促GBM细胞化疗耐药

CGGA数据库分析发现，IBSP在复发（recurrent， Rec）胶质瘤样本中表达水平显著高于原发（primary， Pri）样本（P <0.01，图4A）。预后分析发现，TMZ可显著改善IBSP低表达GBM患者生存（P <0.001），而对IBSP高表达GBM患者预后无改善作用（P = 0.087，图4B），提示IBSP可能参与调控GBM细胞TMZ化疗耐药性。课题组既往成功构建了两株 TMZ 耐药 GBM细胞系U251T3rd和N3T3rd^[9]。Western blot和 qRT-PCR检测发现，IBSP在耐药细胞中表达水平显著高于敏感细胞U251S、N3S（图4C、D）。在TMZ敏感细胞系中过表达ISBP，并在TMZ耐药细胞系中敲低IBSP（图4E、F），再行TMZ处理后，流式细胞仪检测发现，过表达IBSP后细胞凋亡水平显著降低（图4G），IBSP敲低则导致细胞凋亡水平显著增高（P <0.05，图4H）。Western blot检测发现，过表达IBSP可显著缩短敏感细胞中凋亡标志物γ-H2AX 的表达时间，而敲低ISBP可显著延长γ-H2AX的表达时间（图4I、 J）。上述结果提示，IBSP可促GBM化疗耐药。

2.5 IBSP激活NF-κB信号通路

利用TCGA数据进行基因集富集分析（gene set enrichment analysis，GSEA）分析发现，IBSP表达水平与NF-κB信号通路激活显著正相关（P <0.05，图5A），提示IBSP可能通过激活NF-κB信号通路维持GBM细胞恶性表型。Western blot检测发现，过表达IBSP 可增加U251S和N3S细胞中p65磷酸化水平（图5B）； 敲低 IBSP 可以显著抑制 U87、LN229、U251T3rd、 N3T3rd细胞中p65磷酸化水平（图5C）。利用TCGA 数据库分析发现，IBSP与NF-κB下游基因mRNA表达水平显著正相关（P <0.05，图5D）。PCR 结果进一步证实，过表达 IBSP 可促进 NF-κB 下游基因 mRNA 表达（P <0.05，图5E）；而敲低 IBSP 可抑制 NF-κB下游基因mRNA表达（P <0.05，图5F）。上述结果提示，IBSP 可通过激活 NF-κB 信号通路促进 GBM恶性进展。

3 讨论

脑胶质瘤是颅内最常见的原发性恶性肿瘤，我国胶质瘤年发病率为5/10万~8/10万^[2]。由于胶质瘤具有高度异质性及放化疗耐受等特性，患者预后极差，5 年病死率仅次于胰腺癌和肺癌^[10-11]。近年来，对胶质瘤的诊断已逐渐从单一组织病理学发展为以组织病理为基础、分子病理为核心的诊疗体系。目前包括IDH1/2、TP53、ATRX等基因突变已被写入胶质瘤诊疗指南，对胶质瘤治疗方案的制定起重要指导作用^[12]。因此，进一步寻找胶质瘤分子标志物对肿瘤诊断及指导治疗具有重要意义。

IBSP 与牙科基质蛋白、骨桥蛋白、细胞外磷酸糖蛋白以及唾液磷酸盐蛋白等同属于 SIBLING 家族^[13-15]。大多数SIBLING家族成员主要存在于骨组织中，而这些蛋白质中包括IBSP在内的一小部分也在恶性肿瘤组织中异常表达^[16-17]。既往研究发现， IBSP异常表达与肿瘤恶性转化、骨转移以及患者不良预后密切相关。目前，IBSP 在胶质瘤中研究较少，只有 2022 年 Ghochani 等^[18] 研究发现 IBSP 对胶质瘤细胞迁移至血管附近并沿血管生长至关重要。因此，IBSP在胶质瘤中的表达水平及生物学功能还需进一步探究。本研究通过生物信息学分析发现IBSP在胶质瘤组织尤其是高级别胶质瘤中表达水平增高，并与患者预后较差密切相关。进一步利用胶质瘤细胞系及课题组既往构建的配对 TMZ 敏感和耐药细胞株行功能实验证实，IBSP促胶质瘤增殖、侵袭和TMZ化疗耐药，提示IBSP是促进胶质瘤进展的重要因素。

NF-κB信号通路是一种在细胞信号转导中极为重要的途径，它在调控免疫反应、炎症反应、细胞生长与死亡等多种生理过程中起关键作用^[19]。该通路能够响应多种刺激，包括促炎细胞因子、自由基、紫外线辐射、细菌和病毒感染等，进而调控多种基因的表达。通常情况下，在细胞质中的NF-κB处于失活状态，与抑制蛋白 IκB 结合成三聚体复合物。当受到外界刺激时，IκB随即从p50/p65/IκB异源三聚体中解离出来，被泛素化修饰后通过蛋白酶体降解。于是，受到IκB抑制的NF-κB得以暴露其核定位序列，迅速从细胞质进入细胞核内，与核内DNA 上的特异序列相结合，从而启动或增强相关基因的转录^[20]。长期以来，大量研究表明NF-κB信号通路与肿瘤细胞发生、增殖、分化、凋亡、侵袭、转移等多种生物学行为密切相关^[21]。在胶质瘤恶性进展中，多个癌基因通过激活 NF-κB 信号通路发挥作用。 Xiao等^[22] 发现，c-myc/XTP6/NDH2轴通过激活NF-κB 信号通路促进胶质瘤恶性进展。本研究通过GSEA 分析结合分子生物学检测发现，IBSP 可显著提高 GBM 细胞中 NF-κB 信号通路激活水平。进一步检测发现，IBSP可调控NF-κB下游靶基因表达水平进而调控GBM细胞增殖、侵袭和TMZ化疗耐药。本研究结果进一步拓展了GBM中NF-κB调控网络，为靶向NF-κB提供了重要理论依据。

综上所述，胶质瘤中IBSP表达水平与其临床预后显著正相关，IBSP高表达促进胶质瘤细胞恶性进展，IBSP可能是胶质瘤患者预后及相关治疗的潜在新靶点。

参考文献