摘要
目的：选择羟基积雪草苷和依克多因为原料，制备一种具有舒缓功效的脂质体乳剂，并评价其透皮效果。方法：细胞实验探究能产生抗炎活性和屏障修复活性的羟基积雪草苷和依克多因的最佳配比；薄膜分散法制备羟基积雪草苷-依克多因脂质体；马尔文粒径仪测定其粒径、分散系数及电位；透射电镜下观察其形态；高效液相色谱法测定溶液中羟基积雪草苷及依克多因含量；透析法测定包封率和载药量；Franz 扩散池测定脂质体的透皮情况。结果：细胞实验确定了羟基积雪草苷和依克多因按照质量比 1∶9 配比，其抗炎活性和屏障修复活性最佳。药物在此配比下，再按照磷胆比 5∶1、药脂比 1∶10 条件下制备得到脂质体，该脂质体羟基积雪草苷包封率为51.33%、羟基积雪草苷载药量0.35%、依克多因包封率26.39%、依克多因载药量1.20%；粒径为166.53 nm，电位为-29.63 mV，PDI为0.20，24 h内累积透过量低于水溶液，无明显突释效应，具有缓释效果。结论：本实验制备的脂质体质量佳，内部颗粒分布均一较为稳定，同时可以达到在皮肤表面的缓释效果，延长功效物质的作用时间。
Abstract
Objective：To prepare a soothing liposome emulsion using madecassoside（MC）and ectoin（EC）as the primary ingredients and to evaluate its transdermal absorption. Methods：The optimal ratio of MC and EC that produced anti-inflammatory and barrier repair activities was determined through cellular assays；MC -EC liposomes were prepared using the thin film hydration. The particle size，dispersibility coefficient，and Zeta potential were measured using a Malvern particle size analyzer. The morphology was observed under transmission electron microscope. The contents of MC and EC in the solution were determined by high-performance liquid chromatography. The encapsulation rate and drug loading capacity were determined by the dialysis method. The transdermal characteristics of the liposome emulsion were evaluated via the Franz diffusion cell method. Results：The cell experiments determined that the best anti-inflammatory and barrier-repairing activities were achieved with a MC to EC mass ratio of 1∶9. Under these parameters， the liposome preparation conditions were optimized with a phosphorus-bile ratio of 5∶1 and a drug-to - lipid ratio of 1∶10. The encapsulation rate of MC in the liposomes was 51.33%，and the drug loading capacity of MC was 0.35%，the encapsulation rate of EC was 26.39%，and the drug loading capacity of EC was 1.20%. The liposomes had a particle size of 166.53 nm，the Zeta potential of-29.63 mV，and the PDI of 0.20. Over a 24 h period，the solution demonstrated a lower cumulative permeability compared with the aqueous control，without exhibiting an abrupt release；instead，a sustained release effect was observed. Conclusion：The MC and EC liposome emulsion prepared in this experiment has a high drug load and stable internal particle distribution，and may achieve slow-release effect on the skin surface and prolong the action time of the effective substance.
Keywords
根据国际瘙痒研究论坛（International Forum for the Study of Itch，IFSI）[1] 及《中国敏感性皮肤诊治专家共识》（2017版）[2]，将敏感性皮肤定义为在受到外界刺激后，皮肤产生阵发性或周期性红肿、热痛、瘙痒及紧绷感。根据流行病学调查可知，敏感性皮肤在全球广泛分布，女性群体中发生率普遍高于男性[3]。敏感性皮肤的发生机制尚未完全明了，大部分认为是皮肤屏障受损导致皮肤血管神经反应性增加所致[4-5]。在《化妆品分类规则和分类目录》中有一类化妆品可以有助于改善皮肤刺激等状态，被认为具有舒缓功效如羟基积雪草苷（mdecas⁃ soside，MC）和依克多因（ectoin，EC）。
MC是一种提取自伞形科多年生草本植物积雪草中的活性物质，是积雪草中含量最高的三萜类物质[6]。积雪草由于其生理活性和药理性被广泛使用于生物医药和日化原料中[7-8]，其各种提取物被认为具有抗氧化、美白、抗炎等多种功效，安全且高效[9]。然而，MC 水溶性差，生物利用率低，导致其很难透过皮肤的表皮层进入真皮层发挥作用。EC学名四氢嘧啶羧酸，可由在极端环境下存活的嗜盐菌分泌；其不仅是生物保护剂，同时可以帮助蛋白、核酸、生物膜乃至整个细胞对抗高温、干燥、冷冻和辐射等多种逆境[10-11]。此外，EC还具有抑制酪氨酸酶活性的作用，减少黑色素产生[12]；减少DNA甲基化所致的皮肤衰老等作用[13-14]。研究表明，MC 与EC 在一定的质量配比下，可以在抗炎活性方面产生协同增效的作用[15]。
脂质体是一种将活性物质包封于磷脂双分子层中形成的小球形囊泡，因具有良好的生物相容性、毒性低、无免疫抑制等优点[16]，被广泛应用于日常生活中的各项领域中[17]。脂质体在化妆品中可以作为包覆载体来提高活性成分的稳定性，增强闭合性和水合作用[18]，还可以延长活性物质作用皮肤的时间实现缓释，到达皮肤的深层[19]。因为人体皮肤具有屏障作用，活性物难以渗透到皮肤深层。所以为了提高活性物利用效率，脂质体在化妆品中有着广泛的应用。随着技术的发展，有研究通过改变脂质体双层膜的结构制备了各种新型脂质体，例如加入乙醇作为促渗剂，降低角质层脂质熔点，提高药物渗透量，或加入表面活性剂作为边缘活化剂，提高囊泡可变形性等[20]。这些技术有助于脂质体更好地穿过皮肤屏障，渗透入更深层的皮肤，达到促渗效果。
本研究首次选择MC、EC为主要活性成分，深入探讨这两种物质的抗炎活性及屏障修复活性；再对这两种物质进行包载，制备MC⁃EC脂质体；对其理化性质、透皮吸收性能等进行评价，为后续这两种物质制剂的开发使用提供实验依据。
1 材料和方法
1.1 材料
实验中用到的小鼠单核巨噬细胞（RAW 264.7） 和人永生化上皮细胞（HaCaT）均购自中国科学院典型培养物保藏委员会细胞库。细胞培养条件为 37℃、5%CO2，培养基为含10%胎牛血清的DMEM。 MC（上海阿拉丁试剂有限公司）；EC、卵磷脂、胆固醇（上海麦克林生化科技股份有限公司）；脂多糖 （Sigma⁃Aldrich 公司，美国）；MTT（广州硕普生物科技有限公司）；小鼠肿瘤坏死因子⁃α（tumor necrosis factor⁃α，TNF⁃α）、人水通道蛋白 3（aquaporin，AQP⁃ 3）、人丝聚蛋白（filaggrin，FLG）酶联免疫吸附试验 （enzyme⁃linked immunosorbent assay，ELISA）试剂盒 （江苏酶免生物科技有限公司）、一氧化氮（nitric ox⁃ ide，NO）试剂盒（南京碧云天生物技术有限公司）。
1.2 方法
1.2.1 细胞毒性实验
将RAW 264.7细胞按照5×105 个/孔的密度接种于 96 孔板中，37℃、5%CO2的细胞培养箱内培养 24 h；按照MC、EC质量浓度分别为0、2.5、5、10、50、 100、300、500 μg/mL 给药，相同条件下继续培养 24 h；24 h后，小心吸去含有药物的上清培养基，每孔加入100 μL含有5 mg/mL MTT溶液，培养4 h后，弃去含有 MTT 的培养基，每孔加入 100 μL DMSO，摇床震荡5 min，在490 nm处测得各孔吸光度值，以评估细胞活性。
1.2.2 抗炎活性检测
将RAW 264.7细胞按照5×105 个/孔的密度接种于 24 孔板中，37℃、5%CO2 的细胞培养箱内培养24 h；24 h后，每孔加入含20 μg/mL脂多糖的无血清 DMEM培养基，构建炎症模型；按照MC、EC、MC：EC 质量比 1∶9、1∶14、1∶19 分成 5 个组，每组设立低、中、高（20、100、200 μg/mL）3个浓度梯度给药，其中的20、100、200为MC与EC两种物质浓度之和。同时设置空白组和阳性组，继续培养 24 h 后，按照试剂盒说明书步骤，测定各孔培养基上层清液中 NO、 TNF⁃α浓度。
1.2.3 屏障修复活性检测
将 HaCaT 细胞按照 5 ×105 的密度接种于 24 孔板中，37℃、5%CO2的细胞培养箱内培养24 h；24 h后每孔按照MC、EC、MC∶EC（1∶9）、MC∶EC（1∶14）、MC∶ EC（1∶19）分成5个组，每组设立低、中、高（20、100、 200 μg/mL）3 个浓度梯度进行给药，其中的20、100、 200为MC与EC两种物质浓度之和。同时设置空白组，继续培养24 h后，按照试剂盒说明书步骤，测定各孔培养基上层清液中FLG蛋白、AQP⁃3蛋白的浓度。
1.2.4 高效液相色谱法测定脂质体溶液中 MC 与 EC的含量及方法学考察
MC检测条件：35℃；色谱柱C18（250 mm×4.6 mm× 5 μm）；流速 1 mL/min；进样量 10 μL；检测波长 205 nm；流动相A相为乙腈；B相为2 mmol/L β⁃环糊精溶液；等度洗脱条件为0~30 min，A与B两者体积比24∶76。
EC检测条件：30℃；色谱柱C18（250 mm×4.6 mm× 5 μm）；流速 0.8 mL/min；进样量 10 μL；检测波长 210 nm；流动相 A 相为 pH=3 的磷酸盐缓冲液 （40 mmol/L磷酸二氢钠⁃10 mmol/L 1⁃庚烷磺酸钠）； B相为甲醇；梯度洗脱条件为0~5 min，A与B两者体积比 95∶5；6~10 min，A 与 B 两者体积比 55∶45；10~15 min，A与B两者体积比70∶30。
配制 5、10、50、100、200、500 μg/mL 的 MC、EC 标准溶液，在上述色谱条件下，测得峰面积和 MC、 EC浓度的关系，以MC、EC浓度为横坐标（X），峰面积为纵坐标（Y），获得X对Y的回归方程及相关系数 r；进行专属性、精密度及准确度的方法学验证[21]。
1.2.5 薄膜分散法制备脂质体
精密称取定量的磷脂和胆固醇，溶于10 mL三氯甲烷中，使用旋转蒸发仪在真空条件下去除有机溶剂，旋蒸60 min，在圆底烧瓶内部形成均匀的脂质薄膜。加入 5 mL 含有 MC 和 EC 的 PBS 溶液，水合 40 min，超声60 s，过0.45 μm滤膜，可得MC⁃EC脂质体。使用马尔文粒径仪测定其粒径、电位；TEM 电镜下观察并拍摄制备的脂质体颗粒。
以MC与EC的包封率、载药量为评价指标，考查不同磷胆比、药脂比对脂质体质量的影响，磷胆比为 A因素，药脂比为B因素，按表1内计划进行制备。
表1制备实验考查因素
Table1Preparation of experimental investigation factors
1.2.6 透析法测定脂质体包封率及载药量
本研究使用透析法分离脂质体和游离药物，精密量取pH=7.4的PBS缓冲液150 mL作为透析介质，选择分子量8 KD~14 KD的透析袋，吸取2 mL的MC⁃EC 脂质体于透析袋中，室温、磁力搅拌（400 r/min）下透析。在前期预实验中发现，游离MC在3 h可被透析完全，游离EC在2 h可透析完全，本实验选择在3 h 后吸取透析袋内液体1 mL，加入等体积甲醇混匀后在1.2.4的色谱条件下分别测定其中MC和EC的含量计为m1，同时测定未透析前脂质体中MC和EC的含量计为m。加入的磷脂和固醇的重量计为M，分别计算包封率、及载药量。包封率=m1/m×100%；载药量=m1/ （m+M）×100%。
1.2.7 脂质体的体外透皮实验
使用Franz立式扩散池，接收池体积8 mL，扩散面积为 3.14 cm2，扩散池体积 1 mL。扩散条件为水浴温度32℃，转速300 r/min，恒温搅拌。将猪皮清洗干净后裁成合适大小，夹在扩散池和接收池中间，使角质层朝向扩散池方向。接收池中添加8 mL 生理盐水为接收液，扩散池中分别加入MC ⁃ EC水溶液、MC⁃EC脂质体溶液各1 mL。在第1、2、4、6、8、 10、12、24 h分别从接收池中取8 mL接收液，后立即添加等温等体积的生理盐水进入接收池[22]，使用高效液相色谱法，测定其中EC含量，统计24 h累积透过量Qn，计算公式为：
其中：Cn 为各时间点取样后的 EC 质量浓度 （μg/mL）；A为扩散面积（cm2）；V为各时间点固定取样体积（mL）。
1.3 统计学方法
使用 SPSS22 进行统计学分析，所有数据均为 3 次平行实验算数的平均值±标准差（），采用单因素方差分析比较各组间差异，LSD⁃t 检验用于组间两两比较。使用 SPSSAU 软件进行数据加权分析；其余所得实验数据使用 Origin2022 软件处理。 P <0.05 为差异有统计学意义。
2 结果
2.1 细胞毒性实验
不同浓度 MC 和 EC 对 RAW 264.7 细胞活性实验结果如图1，各组间差异无统计学意义，可认为 MC 和 EC 在 0~500 μg/mL 浓度范围内无细胞毒作用，为后续细胞实验选择浓度梯度提供了依据。
2.2 抗炎活性实验
如图2所示，使用脂多糖刺激 RAW 264.7 细胞构建炎症模型后，各组细胞培养液上层中均有NO、 TNF⁃α分泌。同时，随着给药浓度的增加，炎症因子的分泌量也随之减少，证明无论是单独用药，还是联合用药 MC 和 EC 都具有一定的抗炎活性。但同样的给药浓度下，MC∶EC（1∶9）组NO、TNF⁃α浓度显著低于其他组别（P均<0.05）。表明MC 和 EC 两种物质质量比为 1∶9 时，其抗炎活最佳，不仅高于两种物质单独作用，也高于 MC∶EC（1∶14）组和MC∶ EC（1∶19）组。
图1MC和EC对RAW 264.7细胞活性影响（n=9）
Figure1Effect of MC and EC on the toxicity of RAW 264.7 cells（n=9）
2.3 屏障修复活性实验结果
在屏障修复活性实验部分，本研究选择 FLG、 AQP⁃3的分泌量为评价指标。如图3所示，增加给药浓度后，两项指标均有增加。其中 FLG 分泌量在低剂量 20 μg/mL 下各组间差异无统计学意义。当增加浓度到 100、200 μg/mL 剂量时，给药组中 MC∶EC（1∶9）组 FLG 分泌量显著性高于空白组、 MC、EC组和其他质量比组（P均<0.05）。在低剂量时，MC∶EC（1∶9）组AQP⁃3分泌量显著高于空白组、 MC和EC组（P均<0.001），3个配比组间差异无统计学意义。而在中、高剂量组中MC∶EC（1∶9）组分泌量不仅显著高于空白组、MC 和 EC 组，也高于其他质量比组（P均<0.05）。表明MC和EC两种物质组合配比后屏障修复活性高于两种物质单独作用，其质量比为1∶9时屏障修复活性最佳。
2.4 高效液相色谱法测定溶液中MC、EC含量的方法学确认
在 1.2.4 的色谱条件下，分别测定 MC、EC 标准溶液，获得以 MC、EC 浓度为横坐标（X），峰面积为纵坐标（Y），获得 X 对 Y 回归方程，MC 为 y=2.276 56x+0.799 58（r=0.999 9）；EC为y=34.722x+114.9（r= 0.999 9），证明 MC、EC 在 5~500 μg/mL 范围内线性关系良好。图4色谱图显示，MC标准溶液在13 min 左右而EC标准溶液在3 min左右出现色谱峰，空白脂质体在此时间内无干扰，专属性好；精密度及准确度考察结果见表2、3，可知该方法测定溶液中 MC、EC含量精密度好，准确度高。
2.5 脂质体制备试验
参考细胞实验结果，MC 与 EC 在质量比为 1∶9时，抗炎活性和屏障修复活性最佳，故选择此质量配比进行脂质体制备。以MC包封率（Y1）、MC载药量（Y2）、EC包封率（Y3）、EC载药量（Y4）为评价指标，使用SPSS AU软件进行综合评分分析。获得Y1、Y2、 Y3、Y4 的权重分别为 11.25%、47.07%、1.34%、 40.34%，计算每组综合评分。实验结果见表4，由此可以看出，考察因素对Y1、Y2、Y3、Y4的影响程度为A （磷胆比）<B（药脂比）；最优组合为A2B1，即磷胆比 5∶1，药脂比1∶10。在此条件下制备的脂质体MC包封率为 51.33%、MC 载药量 0.35%、EC 包封率 26.39%、EC 载药量 1.20%（表4）。由图5可知该组的粒径为166.53 nm，电位为-29.63 mV，PDI为0.20。除了最优组外，其余各组粒径为150~200 nm，PDI系数均在0.3以下，说明制备出的脂质体内部均一，粒径分散均匀。电位绝对值均>20 mV，说明粒子间的电荷排斥力大，不易发生凝聚和沉淀。图6TEM显示制备出的脂质体近似球形。以上表明此工艺可以获得较为稳定的MC⁃EC脂质体。
图2MC、EC、MC∶EC质量比1∶9、1∶14、1∶19对LPS刺激下RAW 264.7细胞产生的炎症因子分泌水平的影响
Figure2Effects of MC，EC，as well as combined MC and EC（mass ratio 1∶9，1∶14 and 1∶19）on the secretion levels of in⁃ flammatory factors induced by LPS stimulation in RNW 264.7 cells
图3MC、EC、MC∶EC质量比1∶9、1∶14、1∶19对HaCaT细胞分泌FLG、AQP⁃3的影响
Figure3Effects of MC，EC，as well as combined MC and EC（mass ratio 1∶9，1∶14 and 1∶19）on the secretion levles of FLG and AQP⁃3 in HaCaT cells
图4高效液相色谱法测定溶液中MC（A）、EC（B）含量
Figure4Determination of MC（A）and EC（B）content in solution by HPLC
2.6 脂质体体外透皮实验结果
如图7所示，MC+EC水溶液和脂质体溶液的累积透过量均随时间的延长而增加，在前1 h内，MC+ EC水溶液和脂质体溶液中的有效成分均无透过；在 2 h时，水溶液中有效成分开始有渗出，而脂质体溶液仍未透过；4 h至24 h，两者皆有渗出，但脂质体溶液的累积透过量低于水溶液，且无明显突释效应，说明本研究制备的脂质体溶液和水溶液相比具有缓释效果。
3 讨论
本研究采用薄膜分散法以卵磷脂和胆固醇为膜材料，制备了MC与EC复合活性成分脂质体。通过正交实验得到制备脂质体的最佳条件为磷胆比 5∶1，药脂比1∶10，在此条件下制备出稳定的MC⁃EC 脂质体：MC包封率为51.33%、MC载药量0.35%、EC 包封率26.39%、EC载药量1.20%；粒径为166.53 nm，电位为-29.63 mV，PDI为0.20。
表2MC、EC的精密度结果
Table2Precision results of MC and EC
RSD：relative standard deviation.
脂质体溶液因具有和皮肤细胞相似的双分子层，故可以增加被包裹活性物质在皮肤角质层中的积蓄量，达到缓释的效果[23]。本研究中体外透皮实验表明，脂质体溶液累积透过量明显低于水溶液，证明该脂质体溶液具有缓释效果，可以增加MC 和 EC在皮肤中发挥活性作用的时间。通过细胞实验发现，MC和EC在500 μg/mL以内无明显细胞毒性，同时有效地抑制了经 LPS 诱导的 RAW 264.7 细胞炎症因子的产生，屏障修复效果良好，说明本研究制备的脂质体溶液舒缓效果佳。临床研究表明敏感皮肤的人群在使用护肤品后皮肤屏障修复功能有显著提升，敏感状态也有所下降[24]，所以使用具有舒缓功效的护肤品对于皮肤敏感人群必不可少。
表3MC、EC的加标回收率和准确度结果
Table3Results of recovery rate and accuracy of MC and EC
表4MC⁃EC脂质体制备实验及结果
Table4MC ⁃ EC liposomes preparation experiment and results
A1：phosphorus⁃bile ratio of 3∶1；A2：phosphorus⁃bile ratio of 5∶1；A3：phosphorus⁃bile ratio of 7∶1；B1：drug⁃to⁃lipid ratio of 1∶10；B2：drug⁃to⁃ lipid ratio of 1∶20；B3：drug⁃to⁃lipid ratio of 1∶30. Y1：the encapsulation rate of MC；Y2：the drug loading capacity of EC；Y3：the encapsulation rate of EC；Y4：the drug loading capacity of MC.
图5MC⁃EC脂质体粒径（A）及电位（B）
Figure5Particle size（A）and Zeta potential（B）of MC⁃EC liposomes
图6MC⁃EC脂质体透射电镜图
Figure6Transmission electron microscopy images of MC ⁃EC liposomes
图7MC⁃EC水溶液和MC⁃EC脂质体的累积透过量
Figure7Cumulative penetration of MC ⁃ EC aquecus solution and MC⁃EC liposomes
研究认为 MC 可以通过调整 Nrf2/HO⁃1 信号通路中的蛋白表达，达到促进慢性创面修复愈合、血管生成以及抗衰老等效果[25-26]；EC也可以通过调整 Nrf2/HO⁃1信号通路中的蛋白表达，实现美白功效[12]。所以后续研究将探究该通路上的蛋白信号以解释两种物质联用带来的增效作用。本研究制备的MC与EC复合活性成分脂质体工艺简单、质量稳定、抗炎活性与屏障修复效果良好，为MC与EC的联合使用提供了参考。后续将进一步探讨该脂质体在舒缓类化妆品制备中的应用及相关机制研究。
利益冲突声明：
本文所有作者与本期刊均隶属于南京医科大学，但审稿过程遵循双盲原则，评审和编辑决策完全独立，确保了评审的客观性和公正性。
Conflict of Interests：
All authors of this article and the journal itself are affiliated with Nanjing Medical University. However，the peer review pro⁃ cess follows a double⁃blind principle，with the review and editorial decisions being completely independent，ensuring the objectivity and fairness of the review.
作者贡献声明：
韦伟负责文献回顾和前期研究，制定研究设计，并领导团队完成了实验设置和数据收集计划的实施。宋文鹏设计数据收集工具，并亲自参与数据收集工作，同时还负责数据分析计划的制定与实施。韦伟、宋文鹏、吕宁共同起草了论文初稿，经多次讨论和修订后，由韦伟负责整合各方意见，完成最终稿的撰写。张晓玲及环飞作为资深研究者，对韦伟在研究设计和数据分析方面提供了重要的学术指导与支持。
Author’s Contributions：
WEI Wei was responsible for the literature review and pre⁃ liminary research，developed the research design，and led the team in implementing the experimental setup and data collec⁃ tion plan. SONG Wenpeng designed the data collection tools and personally participated in data collection，while also being responsible for formulating and implementing the data analysis plan，including the use of statistical software and interpretation of results. WEI Wei，SONG Wenpeng，and LÜ Ning jointly drafted the initial manuscript，which，after multiple discussions and revisions，was finalized by WEI Wei，who integrated feedback from all parties to complete the final version. ZHANG Xiaoling and HUAN Fei，as senior researchers，provided important aca⁃ demic guidance and support to WEI Wei in research design and data analysis.