摘要
目的：利用反向遗传学技术拯救重组H1N1 pdm09病毒，评价其在MDCK细胞和鸡胚内的生长特性以及对BALB/c 小鼠的致病性。方法：RT-PCR技术扩增A/Puerto Rico/8/1934（简称PR8）病毒基因片段，并克隆至pHW2000双向表达载体上。全球共享流感数据倡议组织（global initiative of sharing all influenza data，GISAID）数据库中下载A/Wisconsin/588/2019（H1N1） 的血凝素（hemagglutinin，HA）和神经氨酸酶（neuraminidase，NA）序列，将其HA非编码区替换为A/California/07/2009（H1N1）的 HA非编码区。全基因合成A/Wisconsin/588/2019的HA和NA片段，分别克隆至pHW2000双向表达载体上。将PR8病毒6个内部基因重组质粒与A/Wisconsin/588/2019的HA和NA重组质粒共转染293T细胞与MDCK细胞，拯救重组病毒。对重组病毒进行血凝效价测定和RT-PCR鉴定以判断是否拯救成功。将重组病毒接种MDCK细胞和9~10日龄鸡胚，评价其生长特性并绘制生长曲线。将重组病毒以滴鼻方式感染BALB/c小鼠，记录小鼠体重变化和生存率以评价其致病性。结果：成功拯救出重组 A/Wisconsin/588/2019病毒，血凝效价为1∶8，测序鉴定其HA和NA序列与预期一致，重组病毒接种MDCK细胞后72 h，大部分细胞完全脱落，病毒滴度为105.38TCID50/mL，复制高峰期为接种后60 h，接种鸡胚后的血凝效价最高可达1∶28 。重组病毒（病毒稀释比为1∶1）滴鼻BALB/c小鼠后第8天，小鼠全部死亡，对小鼠的半数致死剂量为10-1.38/50 μL。结论：成功拯救一株重组H1N1 pdm09病毒，该病毒在MDCK细胞上生长良好且具有良好的鸡胚适应性，对小鼠具有致病性和致死性，为反向遗传学技术快速拯救流感病毒提供新思路。
Abstract
Objective：This study aims to rescue a recombinant H1N1 pdm09 virus by reverse genetics method and evaluate its growth characteristics in MDCK cells and eggs as well as its pathogenicity in BALB/c mice. Methods：The six internal gene segments of A/Puerto Rico/8/1934（PR8）virus were amplified by RT-PCR and cloned into pHW2000 bidirectional expression vector. The sequences of hemagglutinin（HA）and neuraminidase（NA）of A/Wisconsin/588/2019（H1N1）were downloaded from global initiative of sharing all influenza data（GISAID）database，the HA non-coding region of the virus was replaced by that of A/California/07/2009 （H1N1）. HA and NA of A/Wisconsin/588/2019 were synthesized and cloned into pHW2000 bidirectional expression vector. Both the six internal gene recombinant plasmids of PR8 and the HA and NA recombinant plasmids of A/Wisconsin/588/2019 were co-transfected into 293T and MDCK cells to rescue the recombinant virus. The recombinant virus was identified by hemagglutination test and RT-PCR analysis. The recombinant virus was inoculated into MDCK cells and 9- 10 day-old eggs to evaluate their growth characteristics and draw growth curves. BALB/c mice were infected with the recombinant virus by intranasal drip. The changes in body weight and survival rate of the mice were recorded to evaluate the pathogenicity of the recombinant virus. Results：The recombinant A/ Wisconsin/588/2019 virus was rescued. Its hemagglutination titer was 1∶8，and the HA and NA sequences were consistent with expected results. Most MDCK cells were completely shed at 72 hours after inoculation with the recombinant virus，and its viral titer was 105.38TCID50/mL. The peak of replication was 60 hours after inoculation. The hemagglutination titer reached 1∶28 on eggs. All BALB/c mice died on the 8th day after intranasal administration of the recombinant virus with a dilution ratio of 1∶1，and the median lethal dose of the recombinant virus to mice was 10-1.38/50 μL. Conclusion：A recombinant H1N1 pdm09 virus is successfully rescued. The virus grows well in MDCK cells and has good egg-adaptation. It is also pathogenic and lethal in mice. This study provides a new idea for the rapid rescue of influenza viruses by reverse genetics method.
Keywords
季节性流感主要发生在冬季，是由流感病毒引起的急性呼吸道传染性疾病。据世界卫生组织（简称 WHO）统计，全球每年约有 10 亿季节性流感病例，其中包括 300 万~500 万重症病例，导致 29 万~65万病例死亡[1]。流感病毒根据核蛋白和基质蛋白的抗原性分为甲、乙、丙、丁4种类型，其中甲型流感病毒（influenza A virus，IAV）能引起流感大流行[2]，高峰期给人类医疗体系带来巨大负担。
IAV是负性分节段RNA病毒，完整的病毒粒子包含8个基因片段，每个基因片段包括两端影响病毒组装和复制的非编码区和编码病毒蛋白的编码区[3]，8个片段分别编码血凝素（hemagglutinin，HA）、神经氨酸酶（neuraminidase，NA）、碱性聚合酶 1 （polymerase basic 1，PB1）、碱性聚合酶2（polymerase basic 2，PB2）、酸性聚合酶（polymerase acidic，PA）、核蛋白（nucleoprotein，NP）、基质蛋白（matrix protein， M）和非结构蛋白（non⁃structural protein，NS），其中 HA 和 NA 是IAV表面抗原蛋白，负责病毒感染和释放，决定病毒亚型[4-5]。目前人群中流行的IAV亚型是H1N1和H3N2，最近一次流感大流行在2009年由 H1N1引起，由于H1N1取代了之前传播的病毒，因此 2009年之后的H1N1病毒也被称作H1N1 pdm09[6]。 IAV易发生抗原漂移和抗原转换，变异和传播速度非常快，接种疫苗是预防季节性流感的最佳方法[7-8]。
反向遗传学技术是一种新兴的分子生物学技术，可在获得病毒核苷酸序列信息的基础上，将病毒cDNA克隆于细菌质粒后转染合适的细胞，从而拯救具有感染性的病毒粒子[9]。季节性流感疫苗株需要根据流行情况进行更新，传统的疫苗生产方法为遗传重配法，通常是将高产毒株 A/Puerto Rico/8/1934 （简称PR8）与野生型毒株混合感染使毒株间发生基因片段交换造成重配，用特异方法筛选出含有野生型毒株免疫原性基因片段的重配毒株，此过程耗时且不可预测[10]，相比之下反向遗传学技术显然是一种可选择的方法，可在更短时间内产生指定基因组合的流感疫苗株[11]。此外反向遗传学技术可对病毒基因组进行修饰或改造，如基因点突变、插入、缺失及置换等，产生具有指定变异的病毒粒子，以用于病毒的致病性、复制调控、遗传进化和宿主适应性等基础研究。
IAV存在复杂的RNA二级结构，其反向遗传拯救难度较其他病毒增加。影响IAV拯救成功率的实验因素众多，且不同亚型的 IAV 拯救成功率相差较大，即使拯救成功也存在不能正常生长的缺陷病毒[8]。本研究利用反向遗传学技术，以PR8病毒内部基因为骨架，2021—2023 年北半球候选疫苗株 A/ Wisconsin/588/2019（H1N1）的 HA、NA 为表面抗原，通过非编码区的更换，成功拯救一株重组 H1N1 pdm09病毒，为H1N1疫苗株的快速制备提供新思路。
1 材料和方法
1.1 材料
293T细胞、MDCK细胞、PR8毒株和用于流感病毒拯救的双向表达载体pHW2000由中科南京生命健康高等研究院提供。DH5α和Stbl3感受态细胞（上海昂羽生物公司），SPF级鸡胚（江苏勃林格殷格翰公司），10周龄雌性SPF级BALB/c小鼠（浙江维通利华公司）。所有动物实验经中科南京生命健康高等研究院动物伦理委员会审批通过（2406001）。
FastPure Viral DNA/RNA Mini Kit、FastPure Gel DNA Extraction Mini Kit 和ClonExpress® Ⅱ One Step Cloning Kit（南京诺唯赞公司），PrimeScrip RT reagent Kit 和 PrimeSTAR HS DNA Polymerase（Takara 公司，日本），NucleoBond Xtra Midi（MN 公司，德国）， 0.25% Trypsin⁃EDTA、Fetal bovine serum、Penicillin⁃ streptomycin、DMEM、Opti ⁃ MEM、LipofectamineTM 2000 Reagent（赛默飞公司，美国），Trypsin（TPCK ⁃ Treated）（上海懋康生物）。梯度PCR仪、恒温CO2培养箱（赛默飞公司，美国），电泳仪、多功能凝胶图像分析仪（上海天能公司），孵化机（德州科裕孵化设备公司）。
1.2 方法
1.2.1 引物设计和基因合成
IAV 基因组反转录引物序列为 Unit12：5′ ⁃ AGCRAAAGCAGG ⁃ 3′，根据 ClonExpress® Ⅱ One Step Cloning Kit要求设计IAV基因通用扩增引物和空载pHW2000线性化引物（表1），所有引物由南京金斯瑞生物科技公司合成。在全球共享流感数据倡议组织（global initiative of sharing all influenza data， GISAID）数据库中下载 A/Wisconsin/588/2019 的 HA （EPI：1661231）和NA（EPI：1661230）序列，并在5′端添加 5′⁃CCGAAGTTGGGGGGG⁃3′，在 3′端添加 5′⁃ GGCCGCCGGGTTATT⁃3′，基因序列合成由上海欣卓生物科技公司进行，测序由安徽通用生物公司进行。
1.2.2 病毒基因组RT⁃PCR及空载pHW2000线性化
按照 FastPure Viral DNA/RNA Mini Kit 说明书提取 PR8 病毒的 RNA，使用反转录引物 Unit12 和 PrimeScrip RT reagent Kit将提取的病毒RNA反转录为 cDNA，以 cDNA 为模板，使用表1的 PCR 引物扩增PR8病毒的8个基因片段，同时利用反向PCR技术使pHW2000载体线性化。1%琼脂糖凝胶电泳验证PCR产物，纯化回收PCR产物并测序鉴定。
表1PCR引物序列
Table1Primer sequences for PCR
1.2.3 构建重组质粒
将回收的病毒基因片段和线性化pHW2000载体按照ClonExpress® Ⅱ One Step Cloning Kit 说明书进行重组反应，产物转化至感受态细胞后涂布到含有氨苄抗性的LB培养板，37℃、5%CO2培养16 h，挑取单菌落进行菌落PCR鉴定，筛选出阳性克隆后送至测序，对序列正确的质粒抽提后-20℃保存备用。
1.2.4 病毒拯救
将293T细胞和MDCK细胞以4.5∶1的比例平铺六孔板中并置于37℃、5%CO2培养箱孵育，待细胞汇合 80%~90%时转染。转染前 2 h 更换无血清 DMEM，取 PR8 病毒 6 个内部基因质粒和目标拯救病毒A/Wisconsin/588/2019的HA、NA质粒各1 μg加入 250 μL Opti ⁃MEM 中，取 16 μL Lipo2000 加入 250 μL Opti⁃MEM 中，两者混合室温静置 20 min 后均匀滴加至细胞表面，置于37℃、5%CO2培养箱孵育，转染6 h后更换无血清DMEM，转染后24 h更换含有浓度为2 μg/mL TPCK胰酶的DMEM继续培养，转染后72 h收集培养液离心，取一部分上清液用于后续实验，其余置于-80℃冰箱保存备用。
1.2.5 被拯救病毒鉴定
按照全国流感监测技术指南红细胞凝集实验的方法测定转染 72 h 后上清液的被拯救流感病毒血凝效价。用试剂盒提取转染上清液中被拯救病毒的 RNA，RT⁃PCR 后 1%琼脂糖凝胶电泳验证产物，胶回收纯化HA、NA片段后测序鉴定。
1.2.6 病毒在MDCK细胞上的生长曲线测定
将被拯救病毒以 MOI=0.1 接种 MDCK 细胞，于 37℃、5%CO2 细胞培养箱中孵育 2 h，更换含有浓度为 2 μg/mL TPCK 胰酶的 DMEM 继续培养，观察细胞病变情况，于12、24、36、48、60、72 h收取上清液进行半数组织培养感染剂量（50% tissue culture infective dose，TCID50）测定，每个时间段测3个平行孔，绘制病毒在 MDCK 细胞上的生长曲线，判断该病毒在MDCK细胞上的最佳生长时间。
1.2.7 病毒的鸡胚扩增
将转染72 h后的上清稀释10倍后接种9~10日龄SPF级鸡胚尿囊腔，每枚100 μL，置于37℃、60% 湿度的孵化箱中培养，在24、48、72、96、120、144 h每个时间点取3枚接种后的鸡胚收取尿囊液测定其血凝效价，判断被拯救病毒在鸡胚上的适应性，将血凝效价高的病毒尿囊液4℃、3 500 r/min离心20 min，-80℃冰箱保存。
1.2.8 病毒小鼠致病性评价及半数致死量（median lethal dose，LD50）测定
将10~12周龄雌性BALB/c小鼠随机分为4组，每组 5 只。0.45 μm 滤膜过滤病毒尿囊液后用 PBS 将病毒液以 10 倍梯度稀释，稀释比依次为 1∶1、 1∶10、1∶100，对照组为PBS。小鼠按照体重注射三溴乙醇后每组每只滴鼻50 μL病毒液，观察小鼠每天状态，当小鼠体重下降至滴鼻前体重的75%时判定为死亡并立即执行安乐死[12]，记录滴鼻后14 d小鼠的体重变化情况和死亡情况并绘制小鼠体重变化曲线和生存曲线。
1.3 统计学方法
使用GraphPad Prism 9软件进行数据统计并绘制病毒生长曲线、小鼠体重变化曲线和生存曲线。计量资料用均数±标准差表示。
2 结果
2.1 病毒基因组RT⁃PCR及pHW2000线性化结果
PR8 病毒 8 个基因片段 PCR 及 pHW2000 线性化结果见图1，条带大小正确，胶回收后测序结果正确。
图1PR8基因片段扩增及pHW2000线性化结果
Figure1Amplification of gene segments from PR8 and linearization of pHW2000
2.2 重组质粒构建结果
PR8病毒8个基因片段重组质粒电泳结果见图2A，条带位置正确，测序结果正确。A/Wisconsin/ 588/2019的HA片段中有影响大肠杆菌生长的有毒序列，将重组质粒转化至大肠杆菌后，大肠杆菌几乎不生长，将非编码区替换为 A/California/07/2009 （H1N1）病毒的非编码区，得到的重组质粒转化至大肠杆菌后，大肠杆菌可正常生长（图2B）。A/Wis⁃ consin/588/2019 的 HA 和 NA 重组质粒电泳结果如图2C所示。
2.3 病毒拯救结果
以“6+2”模式将构建的 PR8 病毒 6 个内部基因重组质粒与 HA、NA 重组质粒共转染 293T 与 MDCK细胞，同时另转染 PR8 病毒 8 个基因重组质粒作为阳性对照，72 h 后取上清液测定血凝效价。阳性对照 PR8 病毒血凝效价为 1∶32，目标拯救病毒 A/Wisconsin/588/2019 血凝效价为 1∶8（图3A）。提取上清病毒 RNA 对其中 HA、NA 片段进行 RT⁃PCR（图3B），测序后序列比对正确，说明病毒拯救成功。
图2重组质粒构建结果
Figure2Construction of recombinant plasmids
2.4 病毒在MDCK细胞和鸡胚上的生长曲线
将被拯救病毒转染后上清液接种MDCK细胞，观察细胞病变，部分细胞在48 h后变圆、皱缩，72 h 后大部分细胞完全脱落（图4A）。收获上清液测定病毒滴度为105.38TCID50/mL，说明该重组病毒A/Wis⁃ consin/588/2019 在 MDCK 细胞上生长良好。以 MOI=0.1的病毒量感染MDCK细胞并在不同时间段收集上清测定 TCID50，绘制病毒 A/Wisconsin/588/ 2019在MDCK上的生长曲线（图4B），重组病毒在感染 MDCK 细胞 60 h 后复制达到高峰。将稀释后的 A/Wisconsin/588/2019 病毒液接种鸡胚尿囊腔后于不同时间段测定血凝效价（图4C），重组病毒A/Wis⁃ consin/588/2019在接种鸡胚后的血凝效价最高可达 1∶28，提示重组病毒具有良好的鸡胚适应性。
2.5 病毒对小鼠的致病性评价及LD50测定
小鼠滴鼻后记录体重变化（图5A），实验组小鼠从滴鼻后第2天开始出现食欲不振，体重下降，行动迟缓等症状，且病毒稀释比为1∶1组小鼠在滴鼻后第8天全部死亡（图5B），说明重组A/Wisconsin/588/2019 对小鼠具有致病性和致死性。计算该病毒的LD50，为10-1.38/50 μL。
图3重组A/Wisconsin/588/2019病毒鉴定结果
Figure3Identification results of recombinant A/Wiscon⁃ sin/588/2019
图4重组A/Wisconsin/588/2019在MDCK细胞和鸡胚上的生长状况
Figure4Growth condition of recombinant A/Wisconsin/588/2019 in MDCK cells and eggs
图5感染后小鼠的体重变化和生存曲线
Figure5Body weight changes and survival curves of the infected mice
3 讨论
1999年，Neumann等[13] 首次开发了只利用病毒 cDNA 就能拯救 IAV 的方法，该方法依赖单向 RNA 聚合酶转录系统，将8个编码IAV基因组的质粒和 4个指导病毒RNP表达的辅助质粒共转染细胞从而产生病毒粒子。2000 年，Hoffmann 等[14] 采用双向 RNA聚合酶转录系统，以病毒cDNA为模板同时合成负义病毒RNA和mRNA，将转染质粒数量从12个减少为8个，提高IAV拯救效率并降低成本。其他研究在此基础上将多个病毒cDNA克隆到一个载体上构建了4/3/1质粒病毒拯救系统，但目前在实验研究及工业生产中所使用的IAV拯救系统仍为8或12 质粒系统[14-16]。反向遗传学技术的出现为IAV的基础研究和药物研发提供了极大便利，例如拯救带有特定位点突变或缺失的流感病毒可用于致病性和宿主适应性研究，构建携带荧光蛋白的重组病毒可追踪其感染轨迹[17]，构建基因修饰后的流感病毒感染肿瘤细胞可使其表面表达某些蛋白质，从而刺激机体免疫系统识别肿瘤细胞，产生免疫应答[8]。 WHO每年根据IAV流行情况预测疫苗株，相比传统重配法，反向遗传学技术能对流感大流行做出快速反应，如2009年H1N1流感大流行期间研究人员利用反向遗传学技术快速构建了抗原匹配的重组疫苗株，避免造成更大损失[10]。
IAV反向遗传技术依赖大肠杆菌扩增含有病毒 cDNA 的细菌质粒，多项研究表明将某些 IAV 基因片段（如PB2、PB1和HA）克隆到反向遗传载体中存在困难，这提示某些流感基因在大肠杆菌中不稳定或“有毒”，且与基因片段两端的非编码区有关[18]。本研究将A/Wisconsin/588/2019的HA全长cDNA导入双向表达载体pHW2000，转化至多种感受态细胞后均出现感受态细胞生长极其缓慢的情况。报道的几种方法可改善这一状况，包括替换感受态，使用重组缺陷的大肠杆菌来繁殖质粒[18]，在低温（25~32°C）下培养转化的大肠杆菌[19]，或者对pHW2000 质粒进行改造以减少有毒基因的表达[20]。有报道称某些IAV非编码区互换不影响病毒增殖且能提高病毒复制效率，因此本研究尝试将不稳定的HA 片段非编码区替换为同为IAV进化树B6进化分支的A/ California/07/2009 的非编码区[21]，发现转化至 Stbl3 感受态细胞后能正常生长，与上述其他方法相比，本方法耗时少、成本低，为不稳定病毒基因的反向遗传质粒构建提供了新方法。
病毒拯救过程中存在诸多影响因素，如质粒纯度、细胞状态、转染操作等。本研究为提高病毒拯救效率，将重组质粒共转染 293T 细胞和 MDCK 细胞，其中 293T 细胞用于产生病毒蛋白和 RNA 并包装病毒，而MDCK细胞作为扩增流感病毒的理想细胞系可使被拯救病毒粒子高效增殖。本研究所拯救重组病毒的6个内部基因来自无法在人体内复制的毒株PR8，大量数据表明这种“6+2”模式的重组病毒对人体健康造成危害的概率很低[22]。本研究参照 WHO 实验室生物安全手册的规定[23]，所有病毒相关实验操作全程在 BSL⁃2 实验室进行。WHO 建议，对于非H5或H7的重组病毒疫苗株，应做的安全性评估包括基因测序、是否在雪貂体内减毒以及连续传代后的遗传稳定性。雪貂是预测流感病毒对人体致病性的最佳动物模型，但由于条件限制本研究并未使用雪貂测试重组病毒的致病性。后续将尝试在细胞或鸡胚连续传代培养重组病毒，完善对其致病性及稳定性的评价。
综上所述，本研究成功拯救一株重组 H1N1 pdm09病毒，该重组病毒在MDCK细胞和鸡胚上表现出良好的适应性，并且对小鼠有致病性，提示无生长缺陷及毒力缺陷。本研究为反向遗传学技术快速拯救流感病毒提供了新思路。
利益冲突声明：
所有作者声明无利益冲突，作者黎燕和季旻珺与期刊出版部同隶属南京医科大学，但审稿决策由独立审稿人和编辑团队负责，未受机构隶属关系的影响。
Conflict of Interests：
All authors declare no conflict of interest. LI Yan，JI Min⁃ jun and the publication department of the Journal of Nanjing Medical University（Natural Sciences）are all affiliated with Nanjing Medical University，but the review decision process is handled by independent reviewers and the editorial team，unaf⁃ fected by institutional affiliation.
作者贡献声明：
黎燕参与研究设计、数据处理，完成初稿；周克茹参与文章修改和润色；季旻珺参与文章修改；王桂芹负责选题，文章写作和修改。
Author’s Contributions：
LI Yan designed experiments，processed the data and com⁃ pleted the first draft；ZHOU Keru revised and polished this arti⁃ cle；JI Minjun revised this article；WANG Guiqin was responsi⁃ ble for selecting topics，writing，and revising the manuscript