摘要
目的：探讨慢性阻塞性肺疾病（chronic obstructive pulmonary disease，COPD）发展过程中 MT-RNR2 样蛋白 1（MT- RNR2 like protein 1，MTRNR2L1）介导的泛凋亡（PANoptosis）调控机制，为寻找 COPD 发病机制提供新思路。方法：通过基因表达综合数据库（Gene Expression Omnibus，GEO）中COPD患者的批量RNA测序（Bulk RNA sequencing，Bulk RNA-seq）数据和单细胞RNA测序（single cell RNA sequencing，scRNA-Seq）数据探究COPD患者肺组织中细胞构成，并分析细胞参与疾病发生的相关通路。在烟雾/脂多糖（lipopolysaccharide，LPS）暴露的小鼠中模拟PANoptosis，评估MTRNR2L1和PANoptosis蛋白表达情况，明确其在COPD发生发展中的作用。结果：Bulk RNA-seq显示COPD患者T细胞反应相关基因的表达变化。scRNA-Seq证实与对照组相比，COPD组的CD8+ T细胞数减少，上皮细胞数增加；MTRNR2L1在COPD患者的免疫细胞和上皮细胞中表达水平上调；COPD患者肺组织、CD8+ T 细胞和上皮细胞中的 PANoptosis 相关基因表达水平降低。暴露于烟雾/LPS的小鼠肺表现出肺泡损伤、PANoptosis 蛋白表达上调，MTRNR2L1 过表达显著抑制细胞 PANoptosis 并下调 ZBP1、Caspase -3、GSDMD 和 MLKL 的水平。结论：CD8+ T 细胞与上皮细胞的差异表达基因分别在泛凋亡相关通路富集，提示PANoptosis参与 COPD 的发生发展，COPD 发病过程中PANoptosis与PANoptosis蛋白表达增高相关，MTRNR2L1对PANoptosis有抑制作用，调节PANopto- sis可能为减轻肺损伤和改善肺通气功能提供新的治疗机会。
关键词
Abstract
Objective：To explore the mechanism of MT -RNR2-like protein 1（MTRNR2L1）- mediated regulation of PANoptosis during the development of chronic obstructive pulmonary disease（COPD），and to provide new ideas for finding the pathogenesis of COPD. Methods：Bulk RNA sequencing（Bulk RNA-seq）data and single cell RNA sequencing（scRNA-Seq）data from COPD patients in Gene Expression Omnibus（GEO）were used to explore the cellular composition in COPD patients’lung tissues and to analyze the pathways involved in the development of the disease. PANoptosis was simulated in smoke/lipopolysaccharide（LPS）-exposed mice，and MTRNR2L1 and PANoptosis protein expression levels were assessed to clarify their roles in the development of COPD. Results：Bulk RNA -seq demonstrated the altered expression of T cell response-related genes between the COPD patients and the normal controls. scRNA-seq confirmed decreased CD8+ T cells and increased epithelial cells in the COPD patients compared with controls. MTRNR2L1 was upregulated in COPD patient immune and epithelial cells，then those of controls PANoptosis-related genes were reduced in lungs， CD8 + T cells and epithelial cells of COPD patients then those of controls：Smoke/LPS-exposed mouse lungs exhibit alveolar damage， increased expression of PANoptosis-related proteins，while MTRNR2L1 overexpression significantly inhibited cellular PANoptosis and downregulated the levels of ZBP1，Caspase -3，GSDMD，and MLKL. Conclusion：The differentially expressed genes in CD8 + T cells and epithelial cells were enriched in pathways related to PANoptosis，suggesting the involvement of PANoptosis in the development of COPD. The process of PANoptosis in the onset and development of COPD was associated with increased expression of PANoptosis-related proteins. MTRNR2L1 exhibited an inhibitory effect on PANoptosis，and regulating PANoptosis may provide new therapeutic opportunities for reducing lung injury and improving lung ventilatory function.
慢性阻塞性肺疾病（chronic obstructive pulmo⁃ nary disease，COPD）是一种慢性气道性疾病，主要症状包括慢性咳嗽、咳痰和喘息等[1-3]。COPD通常分为慢性支气管炎和肺气肿，前者表现为气道炎症和黏液分泌增加，导致气道狭窄；后者则表现为肺泡壁破坏和扩大，导致肺弹性降低和气体交换受损[4-6]。
COPD的发病机制通常与吸烟和长期暴露于有害气体和颗粒物等因素有关[7-8]，涉及炎症介质的释放和白细胞的迁移等各种因素及其相互作用[9-12]，导致气道壁发生炎症反应、气道狭窄和阻力增加的结构性改变，最终致肺通气功能下降[13]。此外， COPD 还伴有肺泡的破坏，逐渐失去正常的结构和功能，导致气体交换功能受损[14]。
基于此，深入探索与COPD 发生发展相关的蛋白质、基因和分子通路对其治疗至关重要。既往对 COPD研究大多聚焦于单一细胞类型的分子层面的机制研究，限制了对COPD这一复杂疾病全面机制的理解与把握[15-16]。
批量 RNA 测序（Bulk RNA sequencing，Bulk RNA⁃seq）技术可以全面检测COPD患者肺组织或相关样本中基因的表达水平，从而识别出与COPD发病相关的差异表达基因（differentially expressed genes，DEG）。这些基因可能涉及炎症、氧化应激、细胞凋亡等多个生物学过程，为揭示COPD的发病机制提供线索。与Bulk RNA⁃seq相比，单细胞RNA 测序（single cell RNA sequencing，scRNA ⁃Seq）技术具有更高的分辨率和敏感性，可以揭示COPD患者肺组织中不同细胞类型的异质性，包括免疫细胞、上皮细胞、内皮细胞等。这种异质性分析有助于理解COPD发病过程中不同细胞类型的作用[17]。
有研究表明T细胞功能异常可导致过度炎症和免疫失调，从而影响COPD的病理进展。内皮细胞在维持血管通透性和免疫反应方面起着至关重要的作用，其功能异常可能导致血管炎症和血栓形成。泛凋亡（PANoptosis）是一种特定的炎症细胞死亡机制，涉及坏死、细胞凋亡和炎症细胞死亡之间的交叉调节[18]。在COPD的发展中，炎症和细胞死亡过程紧密交织，但PANoptosis的作用及其机制仍未完全阐明，本研究旨在更深入地研究 PANoptosis 在 COPD 中的作用，以确定其是否可以作为干预靶点。
1 材料和方法
1.1 材料
1.1.1 RNA⁃seq数据来源
于基因表达综合数据库（Gene Expression Omni⁃ bus，GEO）下载两个单细胞数据集 GSE173896 和 GSE124180。GSE173896数据集包含3份吸烟COPD 患者肺组织样本和3份非吸烟COPD患者肺组织样本的scRNA⁃seq 数据。GSE124180数据集包含6份 COPD患者肺组织样本和15份非COPD患者肺组织样本的Bulk RNA⁃seq数据。
1.1.2 实验动物
选用C57BL/6J雄性小鼠6只，6~8周龄，体重25~30 g，建立COPD模型。小鼠购自北京华阜康生物科技有限公司，饲养于华北理工大学动物实验中心，饲养条件为SPF级。所有动物护理均符合《实验动物的护理和使用准则》。此外，所有饲养和实验方案均符合华北理工大学制定的标准。相关实验通过了华北理工大学实验动物中心伦理审查，符合3R 原则（动物实验伦理审批号：SQ2022042）。
1.1.3 仪器
流式细胞仪（赛默飞公司，美国）；37℃恒温培养箱（上海一恒有限公司）；倒置显微镜（奥林巴斯公司，日本）；PCR仪器（赛默飞公司，美国）；荧光显微镜（徕卡公司，德国）。
1.1.4 细胞与试剂
BASE⁃2B 细胞系购自美国典型培养物收藏中心（ATCC）；10%胎牛血清、1%青霉素⁃链霉素溶液、高糖 DMEM 培养基（赛默飞世尔科技公司，美国）； Annexin V⁃APC/DAPI荧光双染细胞凋亡检测试剂盒 （武汉普诺赛生命科技有限公司）；Mini⁃PROTEAN® TGXTM预制蛋白质凝胶（伯乐公司，美国）；抗 ZBP1 （1∶1 000）、抗 Caspase⁃3（1∶1 000）、抗 GSDMD （1∶1 000）、抗MLKL（1∶2 000）；抗β⁃actin（1∶1 000）、二抗（1∶2 000）；（Abcam 公司，美国）；荧光染料的抗体 EpCAM⁃APC（BD公司，美国）。
1.2 方法
1.2.1 Bulk RNA⁃seq数据分析
使用 R 软件包[19] 对 GSE124180 数据集中 21 例人源肺组织样本（其中 6 例 COPD 患者肺组织样本和15例非COPD患者肺组织样本）的Bulk RNA⁃seq 数据进行表达分析，获取与COPD发生相关的细胞组成与基因表达变化。利用 R 软件包读入上述 Bulk RNA ⁃ seq 数据。利用主成分分析（principal component analysis，PCA）进行样本层面质控。利用 Cluster profiler 包对基因 ID 进行转换，使用 DESeq2 进行 DEG 分析，差异基因筛选标准为 P <0.05 且 |log2（fold change）|>1.5。对筛选出的 DEG 进行基因本体数据库（gene ontology，GO）功能注释及京都基因组百科全书（Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes，KEGG）通路富集分析[20]。
1.2.2 去卷积分析
根据每个样本的基因表达谱和去卷积法，使用 MCPcounter 软件包[21] 获得样本中的细胞组成，进行去卷积分析，推断 Bulk RNA⁃seq 数据队列中的细胞组成和表达。
1.2.3 scRNA⁃seq数据分析
在 GSE173896 数据集中获取 3 例 COPD 患者 （GSM5282537、GSM5282538、GSM5282539）和3例对照组（GSM5282546、GSM5282547、GSM5282548）单细胞数据样本，从单细胞水平探索与COPD发生相关的分子机制。利用Seurat软件包[19] 分析scRNA⁃seq 数据，采用 scater 方法[22] 过滤各数据中基因表达异常值[中位数绝对偏差（median absolute deviation，MAD）>3]。MAD是一种用于衡量数据集离散程度的统计量，可以衡量观测值相对于数据集的中位数的平均偏离程度。对于质控后的数据集，使用 ScaleData 函数进行归一化，并选择前 2 000 个基因进行PCA，将集成数据集进一步简化为二维空间。
1.2.4 聚类分析与细胞注释
根据 PCA 的结果，选出前 20 个主成分进行 UMAP（uniform manifold approximation and projec⁃ tion）聚类分析（resolution=0.1）。利用 IntegrateData 软件包[23] 合并样本的单细胞表达矩阵。在细胞聚类后，利用singleR 进行单细胞注释，判定对应细胞类型。对筛选出的细胞进行DEG分析，DEG筛选的标准同上。使用 Clusterprofiler 软件包对 DEG 进行 GO功能注释和KEGG通路富集分析。
1.2.5 COPD小鼠模型的构建
选取 C57BL/6J 小鼠于实验第 1、14、28 和 42 天给予气管内脂多糖（lipopolysaccharide，LPS）5 mg/kg 注射。给药后将小鼠直立并旋转 10~20 s 以确保 LPS均匀分布。随后小鼠在密室中接受被动烟雾暴露（总悬浮颗粒为300 mg/m3）30 min，2次/d，持续2个月。建模成功后左肺叶取样2份，1份用于Western blot检测，1份在10%甲醛中固定24 h，然后脱水、石蜡包埋和HE染色。使用数字病理扫描仪进行观察。
1.2.6 细胞培养及构建BASE⁃2BOE⁃MTRNR2L1 细胞
BASE ⁃ 2B 细胞和 BASE ⁃ 2BOE ⁃ MTRNR2L1 细胞在含 10%胎牛血清和1%青霉素⁃链霉素溶液的DMEM培养基中，于 37℃、5% CO2和 95%湿度的条件下培养。当细胞达到约 90%的融合度时进行传代。利用携带MTRNR2L1的pcDNA3.1质粒转染BASE⁃2B 细胞。通过碱性裂解法提取pcDNA3.1质粒，并使用 Nanodrop评估其浓度后，于-20℃保存。将293T细胞按每孔1×106 个细胞的比例铺入6孔板中，于37℃ 下培养24 h。在导入质粒与pSPAX2和pMD2G包装因子、氯化钙和BES缓冲盐溶液前1 h更换培养基，培养12 h后再次更换培养基，24 h后收集上清液，经 2 000 r/min离心10 min，用0.45 μm滤膜过滤病毒上清液，等量分装后于-80℃保存。将5×105 个细胞/孔的BASE⁃2B细胞接种到6孔板中，培养24 h后进行感染。将先前制备的病毒在37℃水浴中解冻，与聚凝胺 （2 μg/mL）混合后加入细胞中。感染后在第1、3和5天更换含有嘌呤霉素（1 μg/mL）的培养基。感染后的BASE⁃ 2B细胞过表达MTRNR2L1即BASE⁃2BOE⁃MTRNR2L1。
1.2.7 流式细胞术检测
采用 Annexin V⁃APC/DAPI 荧光双染细胞凋亡检测试剂盒，将BASE⁃2B和BASE⁃2BOE⁃MTRNR2L1 细胞消化后重悬，计数并接种到 24 孔细胞培养板中。在细胞培养箱中培养 12 h 后，用 LPS（1 μg/mL）处理细胞；然后用 1×PBS 冲洗细胞，经胰蛋白酶消化，以 1 000 g离心5 min。将离心得到的细胞沉淀重悬于 Annexin V ⁃FITC 结合液中。对于每个样本，将 195 μL 结合液与 5 μL Annexin V⁃FITC 和 10 μL PI 混合均匀后在室温下孵育20 min，随后对样本进行流式细胞仪检测。
1.2.8 Western blot
将适量肺组织切碎，在含蛋白酶抑制剂的裂解缓冲液中匀浆，并在冰上超声处理。经过12 000 r/ min 离心10 min，离心后收集上清液。使用PierceTM BCA 蛋白检测试剂盒测定蛋白质的浓度。样品与上样缓冲液混合，煮沸并冷却。随后将蛋白质装载到 Mini⁃PROTEAN® TGXTM预制蛋白质凝胶上，先在 80 V下电泳 30 min，再在 120 V 下电泳 90 min。然后将蛋白质转移到 PVDF 膜上，转膜时间为 2 h（电流为 250 mA）。膜于5%脱脂奶、室温下封闭2 h，然后用 1×Tris 盐缓冲液（含 Tween⁃20，即 TBST）洗涤 3 次。一抗包括：抗 Z ⁃DNA 结合蛋白 1（Z⁃DNA binding protein 1，ZBP1）、抗裂解半胱天冬酶 3 （cleaved caspase⁃3）、抗 GSDMD（gasdermin D）、抗混合系列蛋白激酶样结构域（mixed ⁃lineage kinase domain⁃like，MLKL）和抗β⁃肌动蛋白（β⁃Actin），4℃ 下与膜孵育过夜。经过3次TBST冲洗后，用二抗在室温下孵育 2 h。再经过 3 次 TBST 冲洗后，使用化学发光系统对蛋白条带进行显影。
1.3 统计学方法
基因表达综合数据库数据集处理和分析均通过R软件（4.3.0版）完成。采用GraphPad Prism 8和 SPSS 25.0 进行统计分析与作图。计数资料用率表示，采用χ2 检验；定量数据以均数±标准差（）表示，两组间比较采用独立样本t检验，多组间比较采用单因素方差分析，组间两两比较采用LSD. t检验， P <0.05表示差异有统计学意义。
2 结果
2.1 COPD患者肺部基因表达改变
对GSE124180数据集中6例COPD患者肺组织样本和 15 例非 COPD 患者肺组织样本转录组数据利用 PCA 质控，结果未发现明显异常的样本（图1）。通过差异表达分析鉴定出DEG，上调基因包括角蛋白 13（keratin 13，KRT13）、信号传导及转录激活蛋白（signal transducer and activator of transcrip⁃ tion，STATH）、角蛋白6A（keratin 6A，KRT6A）、羧肽酶 A4（carboxypeptidase A4，CPA4）、表面活性蛋白 A2（surfactant protein A2，SFTPA2）等；下调基因包括 LDHC、IGHG1、PCAT14、ITLN1 和 ANKRD20A9P 等 （图2A、B）。对DEG进行GO功能富集分析与KEGG 通路富集分析，发现DEG在细胞组成方面参与组成 T 细胞受体复合物、在生物过程主要参与免疫应答和白细胞迁移等免疫应答相关过程（图2C、D）；在细胞因子及其受体相互作用、T 细胞受体信号传导途径等中均有富集（图2E、F）。
图1对照组及COPD组样本的PCA分析置信椭圆图
Figure1PCA analysis with confidence ellipses for the control and COPD groups
同时，分析结果发现部分DEG参与PANoptosis 相关的生物功能，如 TREM2 基因参与焦亡，H19、 BOK 参与上皮细胞凋亡过程，CCL24、CALCA、 GBP3、POSTN、ADAMTS12、VCAM1 参与对肿瘤坏死因子的应答，SLC7A11 参与炎性细胞凋亡过程 （表1）
2.2 COPD患者肺免疫细胞浸润的改变
进一步对样本基因表达数据进行去卷积分析，获取各样本中细胞组成变化，并对两组样本中细胞组成可视化（图3A）。鉴于DEG主要集中在与免疫反应相关的过程中，故对各样本中免疫细胞组成进行对比分析。结果发现COPD 患者肺组织中CD8+ T 细胞的比例显著低于对照组（P <0.05，图3B）；而T 细胞、NK细胞、中性粒细胞、B 细胞、单核细胞的比例在两组中未见明显异常（P均>0.05）。
图2COPD患者肺部基因表达改变
Figure2Altered gene expression in the lungs of COPD patients
表1PANoptosis相关基因富集分析结果
Table1GO enrichment analysis findings pertaining to PANoptosis
采用 UMAP 算法对两组样本中的细胞进行聚类分析，共鉴定出 10 个细胞亚群（图3C），基于细胞中基因表达模式，分析不同细胞类型中标志基因，采用 SingleR 对各类细胞亚群进行细胞类型注释，共鉴定出 7 种细胞类型，分别是 B 细胞、CD8+ T 细胞、内皮细胞、上皮细胞、成纤维细胞、单核细胞和 NK 细胞（图3D）。结果发现 COPD 组中 CD8+ T 细胞占比显著低于对照组（P <0.05），与 Bulk RNA⁃seq 分析的结果一致。CD8+ T 细胞水平显著减少，表明存在异常免疫反应，提示 CD8+ T 细胞参与的免疫反应可能与 COPD 发生有关。
2.3 COPD患者肺组织MTRNR2L1表达增加
Bulk RNA⁃seq 和scRNA⁃seq数据分析结果均显示 COPD 患者肺部病变中免疫细胞浸润显著，表明其免疫反应的潜在改变。为了证实上述测序数据分析结果，对不同样本中 CD8+ T 细胞、单核细胞和上皮细胞内的基因表达谱进一步研究，结果显示 COPD 组 3 种细胞类型均存在明显的基因表达改变：CD8+ T 细胞中与细胞凋亡调控有关的基因包括穿孔素（perforin1，PRF1）、颗粒酶 A（granzyme A， GZMA）显示出下调的表达模式，单核细胞中 CCL20、MTRNR2L1 显著上调，上皮细胞中 MTRNR2L1表达明显上调（图4）。
图3COPD患者肺免疫细胞浸润的改变
Figure3Altered pulmonary immune cell infiltration in COPD patients
MTRNR2L1 属于 Humanin 蛋白家族，是 COPD 患者肺组织中表达水平升高的基因之一，由线粒体基因 MT⁃RNR2 编码。其功能包括通过抑制Bax活性来抑制细胞凋亡。Humanin是MTRNR2L1所属的更广泛的类别，代表了一类天然存在的线粒体肽，具有抗凋亡特性，可保护细胞避免各种组织类型的程序性细胞死亡。COPD患者肺组织内MTRNR2L1 表达升高可能意味着机体对COPD发生发展起到的保护机制。
2.4 COPD患者肺组织PANoptosis水平变化
本研究中 RNA⁃seq 数据分析显示，COPD 患者肺组织 PANoptosome 相关基因的表达降低，见表1和图5A。scRNA⁃seq 数据分析显示，COPD 患者肺组织 CD8+ T 细胞和上皮细胞中 PANoptosis 相关基因的表达显著降低或缺失（图5B）；此外，CD8+ T细胞和上皮细胞中一些异常表达的基因在与炎症细胞凋亡相关的生物学过程中富集，包括内在凋亡信号通路、NLRP3 炎症小体的组装和细胞坏死反应 （图5C、D）。上述观察结果共同表明 PANoptosis 在 COPD发生中可能发挥作用。
2.5 COPD小鼠模型、细胞培养验证MTRNR2L1过表达可减轻PANoptosis
基于MTRNR2L1在细胞凋亡中的调节作用，假设 COPD 患者体内 MTRNR2L1 的异常升高可能与 PANoptosis 的异常有关，调节 MTRNR2L1 水平可能会改善 PANoptosis。为了验证这一假设，本研究采用烟雾暴露和气管内LPS滴注来建立COPD小鼠模型。正常小鼠肺泡结构清晰、大小均匀，气道黏膜上皮结构完整。COPD 模型小鼠部分肺泡壁塌陷，肺泡表现出不规则的扩大和融合（图6A）。病毒感染后 ZBP1 可诱导坏死性凋亡。Caspase⁃3、GSDMD 和MLKL分别是细胞凋亡、焦亡和坏死性凋亡的标志性蛋白，本研究显示上述标志蛋白在COPD组小鼠的肺部表达增加（图6B），证实了 COPD 诱导的 PANoptosis增加。
此外，在细胞水平实验显示，LPS诱导BEAS⁃2B 上皮细胞的 PANoptosis，相关蛋白表达水平增加。MTRNR2L1 过表达显著抑制细胞 PANoptosis 并下调 ZBP1、Caspase ⁃3、GSDMD 和 MLKL 的水平（图6C~F）。这些实验表明，MTRNR2L1 对 PANoptosis 有抑制作用，COPD 发生后，机体可能会上调 MTRNR2L1水平以抑制细胞凋亡，这可能是肺组织受损后的一种保护机制。
3 讨论
COPD 的病理特征是肺实质破坏和气道炎症，在其病程中观察到的破坏性变化和组织重塑是先天免疫系统和适应性免疫系统细胞之间复杂相互作用的结果[1]。本研究分析Bulk RNA⁃seq数据，鉴定出 KRT13、KRT6A、CPA4、SFTPA2 等上调基因和 LDHC、IGHG1、PCAT14、ITLN1等下调基因，对上述基因进行 GO 功能富集分析，发现其在细胞组成方面主要参与T细胞受体复合物组成，在免疫反应通路中起着关键作用，尤其是 T 细胞受体信号通路； KEGG 通路富集分析显示上述基因参与细胞因子⁃ 细胞因子受体相互作用，强调了T细胞介导的免疫炎症反应可能参与COPD发展[19-20]。
本研究利用 Bulk RNA⁃seq 数据对免疫细胞分析时，发现 CD8+ T 细胞比例明显降低，与既往研究一致。 Eapen 等[24] 观察到，COPD 患者和没有 COPD 的吸烟者在大气道固有层中，CD8+ T 细胞数减少；香烟烟雾可减少病毒特异性 CD8+ T 细胞活化，在对 COPD 患者外周血检测中发现病毒特异性 CD8+ T 细胞数量减少。但有研究发现，CD8+ T 细胞在轻至中度 COPD 患者肺组织中数量增加，这可能与吸烟状况、COPD 严重程度、急性加重和皮质类固醇使用等因素有关。
本研究在 Bulk RNA⁃seq 数据分析免疫细胞组成时发现COPD组的肺组织中CD8 + T细胞比例较对照组显著降低，而 T 细胞、NK 细胞、中性粒细胞、B 细胞、单核细胞的比例在两组中未见明显异常。在 scRNA⁃seq数据中共鉴定出 10 个细胞亚群，基于细胞中基因表达模式，分析不同细胞类型中标志基因，采用 SingleR 对各类细胞亚群进行细胞类型注释，共鉴定出 7 种细胞类型，同样发现 COPD 组中 CD8 + T 细胞比例降低，但 B 细胞、单核细胞、NK 细胞、内皮细胞、成纤维细胞占比在两组中差异无统计学意义；对 CD8+ T 细胞单独分析时，发现差异表达基因在分子功能中主要富集于与抗原结合、MHC 蛋白结合、T 细胞受体结合；在生物过程水平，主要参与 T 细胞激活、白细胞介导的免疫等过程；在KEGG 通路富集分析中，主要参与在抗原处理和呈递及 NK 细胞介导的细胞毒性等方面。这表明 CD8+ T 细胞中的差异表达基因参与免疫应答过程，而 COPD 组中这些基因表达显著降低，说明 COPD 患者 CD8+ T 细胞的功能可能存在异常，无法进行正常的免疫反应。同时，还显示COPD患者表现出更高比例的上皮细胞，这可能是由于炎症诱导的增殖反应，以期修复组织损伤。
图4CD8+ T 细胞（A）、上皮细胞（B）及单核细胞（C）DEG火山图
Figure4DEGs in CD8+ T Cells（A），epithelial cells（B），and monocytes（C）
图5COPD患者肺组织PANoptosis水平改变
Figure5Altered PANoptosis levels in the lungs of COPD patients
全细胞死亡是一种总体的细胞死亡途径，包括细胞凋亡、坏死性凋亡和焦亡[25]。NR2C2 也称为 TAK1，主要参与细胞分化和发育调节[26]，其与全凋亡直接关联的研究较少。ZBP1在感染和炎症反应中起着至关重要的作用，可能通过激活 RIPK1 和 RIPK3 诱导细胞焦亡；RIPK1 是坏死性凋亡途径的关键，尤其是在与 RIPK3 相互作用时，最终导致 MLKL 磷酸化导致坏死性凋亡[27]。此外，RIPK1 还可以介导细胞凋亡和细胞焦亡[28]。CASP8 是细胞凋亡的关键执行因子，也可以通过抑制 RIPK1 的激活来避免发生坏死性凋亡，CASP1与 NLRP3等炎症小体的激活密切相关，是焦亡的先锋，在NLRP3 炎症小体组装后被激活，促进炎性细胞因子IL⁃1β和IL⁃18 的成熟和释放[29]。凋亡相关颗粒样蛋白（ASC）对于焦亡和炎症小体的组装至关重要，尤其是在NLRP3 炎症小体的背景下[29]，NLRP3 充当炎症小体内的传感器，在病原体或损伤相关分子模式引起的细胞损伤时被激活，进而引起 CASP1 激活，随后导致焦亡[29]。
图6MTRNR2L1过表达与细胞凋亡的关系
Figure6Relationship between MTRNR2L1 overexpression and apoptosis
MTRNR2L1是 Humanin蛋白家族的一部分，具有抗凋亡特性[30]，其在COPD患者肺部高表达提示在疾病展过程中，MTRNR2L1在抵抗细胞凋亡中发挥作用。本研究在对CD8+ T 细胞、单核细胞和上皮细胞等特定细胞类型的深入研究中发现该基因表现出差异表达模式，佐证了其在COPD细胞动力学中的潜在意义。基于上述研究可以发现，多种基因在PANoptosis凋亡领域发挥作用。
本研究通过COPD小鼠模型实验对MTRNR2L1 的保护作用进行验证。暴露于烟雾和LPS导致的肺泡损伤类似COPD症状，过表达MTRNR2L1抑制了上皮细胞中的PANoptosis。同时，本研究发现COPD 患者肺部 PANoptosis 相关基因水平的改变。Bulk RNA ⁃ seq 和 scRNA ⁃ seq 分析均显示 COPD 患者 PANoptosis 相关基因的表达降低，尤其是在 CD8+ T 细胞和上皮细胞中。这一发现表明异常的PANop⁃ tosis过程可能在COPD中起作用。
PANoptosis是最近发现的一种炎症性程序性细胞死亡形式，已有的研究确定了坏死性凋亡或焦亡等个体途径在肺部疾病中的作用，PANoptosis 通过组装成为 PANoptosomes 的多蛋白复合物启动泛凋亡过程[31]。本研究中COPD小鼠模型细胞凋亡、细胞焦亡和坏死性凋亡的同时激活，MTRNR2L1过表达可以减少PANoptosis 的发生，其抗凋亡作用与已有证据一致[32]，验证了其保护作用。
本研究的局限性在于：一是本研究的完成基于构建的 COPD 小鼠模型，时间偏短，无法全面反应 COPD疾病全过程改变，同时无COPD患者肺组织标本验证，未来仍需要进行更多的临床样本分析来确认患者 PANoptosis通路的激活；二是未对PANopto⁃ some 进行进一步研究。未来的工作应该探索翻译后修饰、蛋白质⁃蛋白质相互作用和参与 PANopto⁃ some的信号传导。
综上所述，本研究介绍了PANoptosis 作为炎症性肺病发病机制的驱动因素，验证了MTRNR2L1表达的增加意味着保护性反应，阐明 PANoptosome可能为COPD新的治疗靶点以改善 COPD相关疾病中的过度细胞死亡和炎症。未来将通过更多的临床样本及动物实验进一步探究 PANoptosis在COPD发生发展全过程中的重要作用。
利益冲突声明：
所有作者声明无利益冲突。
Conflict of Interests：
All authors declare no conflicts of interest.
作者贡献声明：
戈艳蕾负责课题设计及文章撰写；孙思怡、任泓沁、姚雪鑫、赵倩、李文强负责生信分析、基础实验；陈伟彬、白静负责数据分析；喻昌利、董爱英、刘铁军负责数据收集；付爱双负责课题指导。
Author’s Contributions：
GE Yanlei was responsible for the project design and manu⁃ script writing；SUN Siyi，REN Hongqin，YAO Xuexin，ZHAO Qian，and LI Wenqiang were responsible for bioinformatics anal⁃ ysis and basic experiments；CHEN Weibin and BAI Jing were responsible for data analysis；YU Changli，DONG Aiying，and LIU Tiejun were responsible for data collection；FU Aishuang was responsible for project guidance.
