摘要
目的：探讨β-半乳糖苷α-2，3-唾液酸转移酶3（β-galactoside-α-2，3-sialyltransferase-3，ST3GAL3）在食管鳞癌（esophageal squamous cell carcinoma，ESCC）中的表达及其与患者预后、临床病理特征的相关性，并研究ST3GAL3调控ESCC细胞增殖和迁移的分子机制。方法：运用生信分析、qRT-PCR和免疫组化（immunohistochemistry，IHC）法分别检测ESCC组织和其癌旁组织中 ST3GAL3 的 mRNA 及蛋白表达情况，并分析其与患者预后的关系以及临床病理资料的相关性；通过 CCLE 数据库分析 ST3GAL3基因在不同ESCC 细胞系中的表达情况；构建野生型及酶活突变型ST3GAL3过表达、ST3GAL3敲低表达及其敲低后回复 ST3GAL3 表达的稳转细胞；通过细胞增殖、Transwell 和细胞铺展实验分别检测相应细胞在细胞外基质（extracellular matrix，ECM）上的增殖、迁移和铺展能力；采用Western blot和凝集素免疫共沉淀（lectin-immunoprecipitation，Lectin-IP）法分别检测ST3GAL3对黏附信号通路相关蛋白表达以及整合素Integrin α5和β1上α-2，3-唾液酸化的影响。结果：临床ESCC样本中 ST3GAL3的mRNA表达明显高于癌旁组织（P< 0.01），且其蛋白也在肿瘤组织中高表达，其高表达与患者不良预后正相关，并且与TNM分期（P=0.004）、肿瘤侵犯程度（P< 0.001）以及淋巴结转移（P=0.017）正相关；ST3GAL3通过酶活依赖的方式促进 ECM介导的ESCC细胞迁移；ST3GAL3介导细胞在ECM上的铺展，进而影响黏附信号通路；ST3GAL3可以修饰整合素Integrin α5和β1蛋白上α-2，3-唾液酸化。结论：ST3GAL3在临床ESCC组织标本中高表达，并提示患者预后不良，并与ESCC患者TNM 分期、肿瘤侵犯程度以及淋巴结转移正相关。ST3GAL3可能通过修饰整合素Integrin α5和β1等黏附蛋白的α-2，3-唾液酸化增强ECM介导的ESCC细胞铺展和黏附信号，进而促进细胞迁移。
Abstract
Objective：To explore the expression of β-galactoside-α-2，3-sialyltransferase-3（ST3GAL3）in esophageal squamous cell carcinoma（ESCC）and its relationship with patient prognosis and correlation with clinicopathologic characteristics，as well as to investigate the function and molecular mechanism of ST3GAL3 in cell proliferation and migration. Methods：Bioinformatic analysis， qRT-PCR，and immunohistochemistry（IHC）were employed to measure ST3GAL3 mRNA and protein expression levels in ESCC and adjacent normal tissues，followed by correlation analysis with patient prognosis and clinicopathological data. The expression of ST3GAL3 gene in different ESCC cell lines was analyzed through the CCLE database. We established ST3GAL3-WT and its catalytic site mutant overexpression，as well as ST3GAL3 knockdown and its rescue cells. We assessed cell proliferation，migration，and spreading abilities on ECM using cell proliferation assay and Transwell assay，respectively. The effect of ST3GAL3 on the expression of proteins related to adhesion signaling and the α-2，3-sialylation of Integrin α5 and β1catalyzed by ST3GAL3 was detected by Western blot and lectin-immunoprecipitation（Lectin-IP），respectively. Results：The mRNA expression levels of ST3GAL3 were significantly higher in the ESCC tissues than in the ajacent normal tissues（P< 0.01），with concurrent elevated protein levels in tumor samples. High expression of ST3GAL3 in ESCC was positively correlated with patient poor prognosis and was associated with TNM staging （P=0.004），T classification（P< 0.001），and lymph node metastasis（P=0.017）. ST3GAL3 promoted ESCC cell migration on ECM in a catalytic function-dependent manner. Furthermore，ST3GAL3 mediated cell spreading and adhesion signaling under ECM-coating conditions. Moreover，ST3GAL3 catalyzed the α - 2，3 - sialylation of Integrin α5 and β1. Conclusion：The expression of ST3GAL3 was increased in ESCC tissues，and its high expression was positively correlated with patients’poor prognosis，TNM stage，T classification，and lymph node metastasis. ST3GAL3 enhanced ESCC cell spreading and adhesion signaling on ECM，therefore promoting ECM-mediated cell migration，possibly through the α-2，3 sialylation of adhesion receptors such as Integrin α5 and β1.
2022年国际癌症机构的统计数据显示，食管癌在全球的发病率居第11位，死亡率居第7位，其中一半以上的病例来自中国，国内食管癌的主要病理类型是食管鳞状细胞癌（esophageal squamous cell carcinoma，ESCC）[1]。尽管传统手术、新辅助放化疗、新型靶向及免疫治疗等手段不断发展，一定程度上提高了患者生存率，但其5年生存率仍然偏低，约为 20%[2]。因此，进一步深入探索ESCC的发生发展机制不仅为食管癌患者早期诊断、预后评估和监测提供生物学标志物，而且为个体化干预治疗提供潜在精准靶点，对改善患者预后具有重大意义。
唾液酸化是一种关键的翻译后修饰，属于糖基化修饰，是在特定唾液酸转移酶催化作用下于糖蛋白或糖脂的糖链末端添加唾液酸。唾液酸化调控细胞识别与黏附、介导细胞间通讯、维持蛋白质稳定与功能，主要参与病原体识别、神经系统发育、肿瘤发生发展与转移、炎症及免疫调控等生物学过程[3]。人体内至少存在 20 种唾液酸转移酶，其中β⁃半乳糖苷α⁃2，3⁃唾液酸转移酶3（β⁃galactoside⁃α⁃2，3⁃sialyl⁃ transferase⁃3，ST3GAL3）主要负责将唾液酸从CMP⁃ 唾液酸转移至含半乳糖的底物上，参与糖蛋白和糖脂的末端 2，3⁃唾液酸糖链合成。ST3GAL3 的表达或突变与神经发育、精神疾病（如非综合征性常染色体隐性遗传性智力障碍和West综合征）、炎症（如过敏性嗜酸性粒细胞性气道炎症和类风湿性关节炎中成纤维细胞样滑膜细胞的炎症反应）、囊胚着床、肿瘤发生发展等过程密切相关[4-6]。 ST3GAL3 的表达可以促进相关肿瘤标志物表达、肿瘤细胞迁移、侵袭和耐药[7-9]，提示 ST3GAL3 可能成为肿瘤潜在标志物和潜在治疗靶点。然而，ST3GAL3在 ESCC中的表达情况及生物学功能尚不清楚。
本研究探索了ST3GAL3在ESCC中的表达及其与患者预后、临床病理特征的相关性，进一步研究了ST3GAL3对ESCC细胞增殖和迁移的影响和潜在机制，揭示了ST3GAL3在ESCC中的作用及重要性。
1 材料和方法
1.1 材料
1.1.1 临床标本
收集扬州大学附属医院2012年12月—2014年 12月期间收治的97例ESCC患者术后标本，2022年 12月—2023年12月期间接受手术患者的21对新鲜组织标本，包括 ESCC 癌组织及相应癌旁正常组织 （距离癌组织>5 cm）。所有癌组织及相应癌旁正常组织经病理确诊（纳入患者均拥有完整的临床资料，术前均未接受放化疗治疗）。新鲜标本收集后称取相应量于Trizol 试剂中，置于-80℃冰箱保存。本研究已通过扬州大学附属医院和扬州大学医学院伦理委员会审批（批准号YXYLL⁃2022⁃05），所有患者均知情同意。
1.1.2 试剂
人胚肾细胞 293 细胞（HEK⁃293T，中科院细胞库）；食管癌 KYSE⁃70 细胞（湖南丰晖生物公司）；KYSE⁃410细胞（武汉普诺赛公司）。DMEM和 RPMI1640培养基（HyClone公司，美国），Opi⁃MEM、胎牛血清、细胞胰酶消化液、嘌呤霉素、潮霉素 B （Gibco 公司，美国），Polyethylenimine“Max”（PEI MAX）（Polysciences 公司，美国），无血清细胞冻存液、Trizol 试剂、青霉素⁃链霉素溶液、PBS、TBST、脱脂奶粉、PCR引物、干扰序列（上海生工生物公司）， 4%多聚甲醛固定液和结晶紫染色液（上海碧云天公司），DNA Marker、蛋白Marker、ECL Western 印迹底物、Western blot一抗剥离液（Thermo Fisher Scientific，美国），SDS⁃PAGE 凝胶配制试剂盒（上海雅酶公司），ECM 组分（ 包括 Collagen、Fibronectin 和 Laminin，Merck Millipore公司，美国），限制性内切酶和 T4 连接酶（NEB 公司，美国），Stbl3 感受态细胞 （深圳康体生命公司），Transwell 小室（Corning 公司，美国），MAM ⁃琼脂糖（J ⁃OIL MILLS 公司，日本），ST3GAL3 抗体（Abcam 公司，美国）、β⁃actin （Santa Cruz Biotechnology公司，美国），p⁃FAK、FAK、 Integrin α5 和 Integrin β1 抗体（CST 公司，美国）。 PierceTM BCA 蛋白质测定试剂盒（Thermo Fisher Scientific公司，美国），iScript cDNA逆转录合成试剂盒、SYBR Creen PCR 试剂盒（Bio⁃Rad 公司，美国）， mini、midi 质粒提取试剂盒以及胶回收试剂盒 （QIAGEN 公司，德国），免疫组化试剂盒（Vector Laboratories公司，美国）。
1.2 方法
1.2.1 免疫组化（immunohistochemistry，IHC）
取石蜡包埋的组织切片，60℃烘片 90 min 后，脱蜡、水化，置于柠檬酸修复液中进行高压抗原修复，95℃ 15 min。PBS 缓摇洗片 2 次，每次 5 min。加ST3GAL3一抗4℃孵育过夜，PBS缓摇洗片3次，每次 5 min。二抗 37℃孵育 30 min，PBS 缓摇洗片 3 次，每次 5 min。滴加 3，3⁃二氨基联苯胺盐酸盐 （DAB）显色（镜下及时观察显色情况终止显色），苏木素复染，最后脱水、封片、晾干、镜检拍照。利用免疫反应性评分系统（immunoreactive score，IRS）分析染色结果[10]。
1.2.2 GEO数据库中数据集分析
从GSE119436、GSE130078和GSE11011数据集 （Gene Expression Omnibus，GEO，https：//www.ncbi. nlm.nih.gov/gds）中检索分析ST3GAL3基因的表达谱。
使用 CCLE 在线数据库（https：//sites.broadinsti⁃ tute.org/ccle）分析比较ST3GAL3基因在相关食管癌细胞系中的表达情况。
1.2.3 细胞培养
HEK ⁃ 293T 和 ESCC 细胞（包括 KYSE ⁃ 70 和 KYSE⁃410 细胞）分别使用含有 10%胎牛血清（fetal bovine serum，FBS）和1%青霉素⁃链霉素的DMEM和 RPMI⁃1640培养基培养（包装病毒时不加双抗），培养条件37℃和5% CO2。
1.2.4 质粒构建
pLVX⁃Puro⁃Control（Con）、pLVX⁃Puro⁃ST3GAL3⁃ WT和pLVX⁃Puro⁃ST3GAL3⁃Mutant（A320P和D370Y） 过表达质粒以及pLVX⁃Hygro⁃ST3GAL3⁃WT和pLVX⁃ Hygro⁃ST3GAL3⁃Mutant（A320P和 D370Y）回复表达质粒由苏州泓迅生物科技有限公司构建。
利用pLKO.1⁃Puro载体经过酶切、链接、测序等步骤构建 ST3GAL3 的干扰表达质粒。具体靶向干扰序列如下：ST3GAL3⁃shRNA#1，5′⁃ GTGTTTGGT⁃ GTATTATCATTT⁃3′；ST3GAL3⁃shRNA#2，5′⁃GAAT⁃ TGACGACTATGACATTG⁃3′。
1.2.5 慢病毒包装及稳转细胞系构建
将 ST3GAL3 相关过表达及干扰慢病毒载体与 psPAX2 和 pMD2.G 包装质粒通过 PEI MAX 共同转染至HEK⁃293T细胞中。瞬转12 h后换新鲜完全培养基，48 h和72 h后分别收集过滤分装慢病毒上清液，-80℃保存备用。
利用上述病毒上清液感染相应ESCC细胞2~3 d 后，通过嘌呤霉素或潮霉素B对细胞进行杀伤筛选，最终获得相应抗性的稳转ESCC细胞。
1.2.6 qRT⁃PCR
称取新鲜食管癌和癌旁组织，加入TRIzol试剂，按说明提取总RNA，通过逆转录合成试剂盒逆转录 RNA，采用 SYBR Creen PCR 试剂盒进行 qRT⁃PCR。以GAPDH为内参基因进行分析。基因引物序列见表1。
表1qRT⁃PCR相关的引物序列
Table1Primer sequences for qRT⁃PCR
1.2.7 蛋白质免疫印迹（Western blot，WB）
收取细胞样品，RIPA 裂解液提取总蛋白，BCA 试剂盒测定蛋白浓度，SDS聚丙烯酰胺凝胶电泳分离蛋白，转移到 PVDF 膜上。5%脱脂奶粉/TBST 室温缓摇封闭 1 h，TBST 洗膜，一抗 4℃孵育过夜，回收抗体，TBST洗膜3次，每次10 min，二抗室温下孵育 1 h，TBST 洗膜 3 次，每次 10 min，孵育 ECL 发光液，通过化学成像仪检测目标蛋白表达情况，采集图像。利用Image J 分析获取相关条带灰度值用于统计分析。
1.2.8 凝集素免疫共沉淀（lectin⁃immunoprecipitation， Lectin⁃IP）
收集细胞裂解液，加热蛋白变性后，超声处理裂解细胞，离心吸取上清液 100 μL，作为 Input，放入-20℃冰箱备用，将剩余上清液加入MAM琼脂糖珠中，在4℃轮转孵育2 h，4℃离心弃上清，RIPA裂解液洗琼脂糖珠 3 遍后进行样品处理，最后 WB 检测目的蛋白表达情况。
1.2.9 细胞增殖实验
将稳转细胞接种到预先包被好细胞外基质 （extracellular matrix，ECM）的 12 孔板中，每组细胞每个时间点4个复孔，每天用胰酶消化细胞后，通过台盼蓝染色结合血细胞计数板计数细胞数目，持续计数4 d，处理数据，绘制细胞增殖曲线。
1.2.10 细胞迁移实验
使用24孔Transwell 小室检测分析相关细胞的迁移能力。提前使用ECM包被Transwell小室，在无菌上室中加入100 μL细胞悬液（含1万个细胞），在下室中加入 500 μL 含有 5%FBS 培养基，孵育培养 12~24 h，用镊子小心取出小室，PBS 清洗 2 遍，用 4% PFA 室温固定 15 min，PBS 清洗 2 遍，结晶紫室温染色15~30 min，PBS清洗4遍，显微镜观察染色情况，拍照获取3个随机视野照片，统计分析实验结果。
1.2.11 细胞铺展实验
配制 1%BSA/DMEM 及黏附分析专用培养基 （0.1% BSA+50 mmol/L HEPES/DMEM）。事先用1 mL ECM/PBS（10 μg/mL）4℃包被6 cm培养皿过夜，PBS 清洗1遍，加入1% BSA于37℃培养箱封闭1 h，PBS 清洗1遍，每皿加1.5 mL黏附分析培养基置于培养箱预热备用。将细胞重悬于黏附分析培养基中置于培养箱孵育45 min（每15 min轻弹1次）。将细胞悬液加到相应培养皿中，轻轻摇匀后培养箱中孵育 15 min。轻轻吸弃培养基，PBS轻洗1遍，4% PFA固定10 min后，PBS再次轻洗1遍，显微镜拍照后统计分析。
1.3 统计学方法
采用 GraphPad Prism10 和 SPSS26 软件分析数据。定量数据表示为均数±标准差（），通过 t 检验或 ANOVA 检验进行分析。采用卡方检验分析 ST3GAL3 与临床病理特征的相关性。采用 Kaplan⁃Meier 生存曲线结合Log⁃rank 检验评估生存率。运用 Cox 比例风险回归模型探讨影响食管癌患者生存的危险因素。P<0.05 为差异有统计学意义。
2 结果
2.1 ST3GAL3在ESCC组织中的表达情况
首先在 GEO 数据库（https：//www.ncbi.nlm.nih. gov/geo/）的不同数据集中分析比较了 ST3GAL3 在 ESCC 组织及其癌旁正常组织中的 mRNA 表达情况。分析结果显示，在23对ESCC组织和其相应癌旁正常组织的 GSE130078 数据集中，ST3GAL3 的 mRNA 在肿瘤组织中高表达（图1A）。此外，在 GSE111011和GSE119436数据集中，也得出类似结果（P均<0.01，图1B、C）。
进一步检测21对新鲜ESCC组织及癌旁正常组织中 ST3GAL3 的表达情况，qRT ⁃PCR 结果显示， ST3GAL3 基因在肿瘤组织中的表达水平明显高于癌旁正常组织（P<0.001，图2A）。此外，97 例 ESCC组织石蜡切片的IHC分析表明，ST3GAL3蛋白在肿瘤组织中的表达水平明显高于癌旁组织（图2B）。以上结果表明，ST3GAL3 在 ESCC 组织中的 mRNA 和蛋白表达均显著上调。
2.2 ST3GAL3表达与临床病理资料的关系
为探讨ESCC患者组织中ST3GAL3表达的临床意义，根据上述 IHC 结果中 ST3GAL3 的表达情况，将 ESCC 患者组织样本分为两组，即高表达组（IRS 免疫反应评分>3 分）和低表达组（IRS 免疫反应评分≤3分），对比分析ST3GAL3高表达组和低表达组患者的生存预后情况。Kaplan⁃Meier 生存曲线显示，ST3GAL3 高表达组的 ESCC 患者总生存率比低表达组明显降低（P = 0.002，图2C）
此外，进一步分析 ST3GAL3 表达与临床病理资料的相关性，发现其表达与患者的 TNM 分期 （P=0.004）、肿瘤侵犯程度（T分型，P<0.001）以及淋巴结转移（N分型，P=0.017）呈明显正相关，与年龄、性别、吸烟史、分化程度、肿瘤大小无关（P >0.05，表2）。同时，多因素 COX 比例风险回归模型统计结果显示，ST3GAL3 的表达（P=0.022）和 TNM 分期 （P=0.008）是ESCC患者预后的独立危险因素（表3）。
2.3 ST3GAL3表达对ESCC细胞增殖、迁移能力的影响
为检测 ST3GAL3 对 ESCC 细胞生物学行为的影响，首先利用CCLE数据库检测ST3GAL3在不同 ESCC 细胞株中的 mRNA 表达情况（图3A），选择 ST3GAL3 表达相对较低的 KYSE ⁃410 细胞构建 ST3GAL3 野生型（wild type，WT）以及酶活突变型 （Mutant，A320P and D370Y）过表达稳转细胞系（图3B）。WB验证ST3GAL3过表达结果显示，与对照组细胞相比，ST3GAL3⁃WT及ST3GAL3⁃Mutant组细胞ST3GAL3蛋白表达水平明显升高（P均<0.001，图3B）。
图1ST3GAL3 mRNA水平在ESCC临床标本中高表达
Figure1The expression of ST3GAL3 mRNA was highly expressed in ESCC clinical sample tissues
图2ST3GAL3在ESCC患者组织标本中高表达且与患者预后相关
Figure2ST3GAL3 levels were highly expressed in ESCC patient tissue samples and were associated with clinical prognosis
细胞增殖（ECM包被）实验结果显示，ST3GAL3⁃ WT和ST3GAL3⁃Mutant 组KYSE⁃410细胞与对照组细胞增殖能力差异无统计学意义（P >0.05，图3C）； ECM包被条件下Transwell实验结果显示，与对照组 KYSE⁃410细胞相比，ST3GAL3⁃WT组细胞迁移能力明显增加（P<0.001），而ST3GAL3⁃Mutant组细胞的迁移能力较对照组无明显变化（图3D）。
进一步在 ST3GAL3 内源性高表达的 KYSE⁃70细胞（图3A）中构建 ST3GAL3 敲低（ST3GAL3⁃sh#1 和ST3GAL3⁃sh#2）及相应ST3GAL3⁃WT和ST3GAL3⁃ Mutant 回复表达的细胞系，WB 检测验证 ST3GAL3 敲低及其回复表达效率（图4A）。结果表明，与对照组相比，ST3GAL3⁃sh#1 和 ST3GAL3⁃sh#2 组细胞中的 ST3GAL3 表达明显降低，且可在 ST3GAL3⁃sh#1 中通过 ST3GAL3⁃WT 及 ST3GAL3⁃Mutant 进一步回复其蛋白表达（图4A）。
表2ESCC患者组织中ST3GAL3蛋白表达与临床病理参数分析
Table2Associations between ST3GAL3 expression and clinicopathological parameters in 97 ESCC specimens
表3ESCC患者生存结局影响因素的多因素Cox比例风险回归分析
Table3Contribution of various potential prognostic factors to survival by Cox regression analysis in ESCC samples
而后，在ECM包被条件下，再次分别通过细胞增殖和 Transwell 实验进一步检测细胞增殖和迁移能力，实验结果表明：与对照组相比，ST3GAL3 敲低组和其回复表达组 KYSE⁃70 细胞的增殖能力无明显变化（图4B），而迁移能力在敲低组明显下降 （图4C，P<0.001），重要的是，下降的迁移能力只能被ST3GAL3⁃WT回复，而回复ST3GAL3⁃Mutant表达对迁移没有显著影响（图4C）
2.4 ST3GAL3影响ESCC细胞迁移能力的机制研究
为进一步验证ST3GAL3促进ESCC细胞在ECM 包被条件下迁移的具体机制。通过细胞铺展实验检测ST3GAL3过表达对KYSE⁃410细胞铺展能力的影响，实验结果表明，与对照组细胞相比，ST3GAL3⁃ WT 组细胞在 ECM 上的铺展能力显著增强（P<0.001），而ST3GAL3⁃Mutant组细胞较对照组无明显变化（图5A）。细胞黏附信号通路检测结果显示， ST3GAL3⁃WT 可以上调黏着斑激酶 FAK 的磷酸化 （p⁃FAK）水平，而ST3GAL3⁃Mutant对其表达无显著影响（图5B），表明ST3GAL3可能通过其酶活功能促进食管癌细胞铺展。
图3ST3GAL3通过其酶活功能促进ECM介导的ESCC细胞迁移
Figure3ST3GAL3 promoted ECM⁃mediated cell migration of ESCC cells in a catalytic function⁃dependent manner
整合素家族Integrins作为ECM重要的受体，是介导细胞黏附的主要跨膜糖蛋白，且前期研究发现其中Integrin α5和β1是介导食管癌发生发展，尤其是ESCC细胞黏附和迁移的关键整合素[11-13]。基于此，本研究进一步检测了ST3GAL3对Integrin α5和 β1 蛋白上的α⁃2，3⁃唾液酸化水平的影响。MAM Lectin免疫共沉淀实验结果显示，与Control组KYSE⁃ 410细胞相比，ST3GAL3⁃WT组细胞中α⁃2，3⁃唾液酸化修饰的Integrin α5和β1表达水平上调，而Mutant⁃ ST3GAL3 对其表达无影响，且 ST3GAL3 ⁃ WT 和 ST3GAL3⁃Mutant 对 Integrin α5 和β1 的蛋白表达水平无明显影响（图5C），表明在 KYSE⁃410 细胞中， Integrin α5和β1是ST3GAL3修饰的底物蛋白。
3 讨论
糖基化修饰是一种常见的由一系列糖基转移酶催化的蛋白质翻译后修饰方式，其在蛋白加工成熟、二聚体形成、配受体结合、细胞黏附伸展、分化、增殖、迁移及侵袭等方面起着至关重要的作用，且糖基化修饰的异常与肿瘤的发生发展密切相关[14]。但由于糖基化修饰（糖链结构）的复杂性及时空动态多变性，其在肿瘤演进中的调控机制仍待阐明。在众多的糖基转移酶中，唾液酸转移酶作为一个重要的家族，其介导的唾液酸化修饰的改变和肿瘤发生发展、演进关系尤为密切。异常唾液酸化几乎是肿瘤恶性转化过程中所有步骤的重要调控因素。因此，靶向唾液酸化调节因子，如唾液酸转移酶和神经氨酸酶，是治疗肿瘤的潜在策略。本研究首次揭示了β⁃半乳糖苷α⁃2，3⁃唾液酸转移酶家族中的重要成员 ST3GAL3 在 ESCC 中的表达和作用，强调了其在ESCC中的临床意义。
图4敲低ST3GAL3表达抑制ECM介导的ESCC细胞迁移
Figure4Knockdown of ST3GAL3 expression inhibited ESCC cell migration on ECM
本研究发现ST3GAL3在临床ESCC组织标本中呈现高表达，提示患者预后不良，并与 ESCC 患者 TNM 分期、肿瘤侵犯程度以及淋巴结转移正相关，表明ST3GAL3可以促进ESCC的发生发展。作为癌基因，ST3GAL3在其他类型肿瘤中也发挥着重要作用，例如，ST3GAL3 高表达与乳腺癌患者的不良预后标志物正相关[15]，且可以调控胰腺癌标志物 CA19.9 的表达[7]。然而，ST3GAL3 在某些肿瘤中发挥着抑癌基因的作用，例如，胃癌瘤内 ST3GAL3 的表达与血管淋巴浸润和G3 级组织学分级呈负相关[16]。有趣的是，Mehta 等[17] 发现ST3GAL3在口腔鳞状细胞癌组织中呈现低表达，但ST3GAL3高表达与晚期口腔鳞状细胞癌、神经周围浸润以及淋巴结转移正相关，提示ST3GAL3在口腔鳞状细胞癌不同进展期可能发挥着相反功能。这些研究表明， ST3GAL3 在肿瘤中的作用存在肿瘤类型和时空异质性，这可能和其修饰底物的特异性相关。因此， ST3GAL3在ESCC发生发展不同阶段的具体功能以及其特异性底物糖蛋白表达谱有待进一步阐明。
通过细胞生物学功能实验本研究揭示了 ST3GAL3可以促进ESCC细胞在ECM上的铺展和迁移。与此功能一致的是，Guerrero 等[8] 发现敲低 ST3GAL3可以抑制E-选择素依赖性细胞黏附，从而影响胰腺癌细胞迁移和侵袭；同时，Singh等[18] 报道敲除 ST3GAL3 可以抑制黑色素瘤细胞转移。以上研究表明，ST3GAL3 可以介导相关肿瘤细胞黏附、铺展、迁移、侵袭和转移。然而，ST3GAL3 是否也能够促进 ESCC 的转移尚待进一步验证。本研究发现 ST3GAL3 对 ESCC 细胞的增殖无显著影响，但 Tan等[19] 报道ST3GAL3有助于维持胃癌细胞稳态以及 CCKBR+ 肿瘤细胞的生长。此外，ST3GAL3 上调诱导的唾液酸化促进了高级别浆液性卵巢癌中的肿瘤抑制微环境，靶向α⁃2，3⁃唾液酸化可能重新编程免疫抑制肿瘤微环境，从而增强抗肿瘤免疫并改善卵巢癌对免疫治疗的反应[20]。这些研究提示 ST3GAL3 对肿瘤细胞增殖能力可能是细胞类型依赖性的，且肿瘤微环境是不可或缺的影响因素。因此，后续通过体内相关动物模型检测 ST3GAL3 对 ESCC 细胞增殖、转移及肿瘤微环境的影响或许能够给出合理解释。
图5ST3GAL3可促进ECM介导的ESCC细胞铺展并修饰Integrin α5和β1的α⁃2，3⁃唾液酸化
Figure5ST3GAL3 promoted ECM⁃mediated cell spreading of ESCC cells and catalyzed the α⁃2，3 sialylation of Integrin α5 and β1
Zhang等[9] 报道ST3GAL3可以通过抑制Caspase8/3 凋亡信号介导卵巢癌细胞的紫杉醇耐药，且敲低 ST3GAL3 表达可以增强卵巢癌细胞对顺铂的敏感性[21]。此外，顺铂处理舌癌细胞可以下调 ST3GAL3 的表达[22]。这些研究表明 ST3GAL3 今后有望成为联合紫杉醇或铂类化疗药治疗卵巢癌的潜在靶点。因此，基于本研究的发现，课题组后续将验证ST3GAL3在ESCC放化疗中的作用和意义。
有研究报道，底物糖蛋白的α⁃2，3⁃唾液酸化和末端α⁃2，6⁃唾液酸化修饰间存在竞争关系，肿瘤细胞表面α⁃2，6⁃唾液酸化水平的不同决定着肿瘤细胞生物学功能的异质性[3，23-24]。例如，乳腺癌细胞中ST6GAL1 介导的α⁃2，6⁃唾液酸化水平的高低在乳腺癌转移的不同阶段发挥着不同的功能，α⁃2，6⁃唾液酸化高表达可以促进乳腺癌肺转移[25]，而低α⁃2，6⁃唾液酸化可以帮助乳腺癌循环肿瘤细胞的休眠，抵抗化疗药物的杀伤，从而促进肿瘤细胞远端传播和转移[26]。基于此，猜想底物糖蛋白末端α⁃2，6⁃唾液酸化水平的不同可能是α⁃2，3⁃唾液酸化功能异质性的潜在调控机制，但食管癌转移过程中α⁃2，3⁃唾液酸化和 α⁃2，6⁃唾液酸化间的调控关系有待进一步阐明。
相对于ST3GAL3在肿瘤中的功能，人们对其催化修饰的底物唾液酸化如何介导相关肿瘤细胞生物学功能的具体机制研究还很有限。本研究在ESCC 细胞中发现ST3GAL3可以修饰整合素Integrin α5和 β1上的α⁃2，3⁃唾液酸化，与此一致的是，Qi等[27] 在 HeLa 细胞中也证实了 Integrin β1 是 ST3GAL3 的催化底物，这些证据表明相关整合素可能是ST3GAL3 介导肿瘤细胞黏附和迁移的关键底物蛋白。因此，本研究后续将进一步验证相关整合素上 ST3GAL3介导的α⁃2，3⁃唾液酸化对ESCC细胞黏附信号及迁移的影响。目前报道负责N糖蛋白的α⁃2，3⁃唾液酸化修饰的糖基转移酶主要包括ST3GAL3、ST3GAL4 和 ST3GAL6，且其中 ST3GAL4 发挥主要作用[28]。有趣的是，研究表明3种酶可以通过特异性修饰不同靶蛋白的 α⁃2，3⁃唾液酸化从而介导特定生物学功能[27]。虽然本研究只关注了ST3GAL3，但阐明了其在ESCC中的重要作用和临床意义。后续研究值得关注ST3GAL4和 ST3GAL6在ESCC中的功能机制，其和 ST3GAL3 具体修饰底物间特异性以及他们之间是否可以相互补偿发挥作用。事实上，除了N糖蛋白外，ST3GAL3还可以修饰神经节苷脂（Gangliosides，包括GD1a和 GT1b）、Mucins黏蛋白、唾液酸路易斯寡糖 X（Sialyl Lewis X，sLeX）抗原以及糖胺聚糖[29-31]。因此，进一步全面阐明 ST3GAL3 介导 ESCC细胞黏附和迁移的底物尤为重要，是将来发展生物标记和设计靶向药物的前提。
本研究发现 ST3GAL3 的 mRNA 和蛋白水平在食管癌组织标本中呈现高表达，但其表达上调的潜在调控机制有待进一步阐明。目前已报道多种上游调控因子（例如IL⁃1β等炎症因子、HPV16 E5等癌基因、miR⁃200a、视黄酸、苯的酚类代谢物等）可调控 ST3GAL3 的表达[32-35]。但上述调控都是针对 ST3GAL3的mRNA转录水平，其蛋白水平及其潜在蛋白翻译后修饰的调控机制尚不清楚。因此，后续需进一步揭示 ST3GAL3 在食管癌组织中上调的潜在调控因子，或将有益于潜在多靶点联合治疗。
此外，临床上ST3GAL3缺乏症是一种极其罕见的常染色体隐性遗传病（主要包括West综合征、癫痫、运动发育迟缓、严重智力和行为障碍），其是由 ST3GAL3基因的致病性突变引起（主要包括外显子突变、无意突变、新型双等位基因变异等）[36-39]。另外，ST3GAL3的单核苷酸多态性与注意缺陷多动障碍、年龄相关性白内障、风险儿童时期的攻击性行为等疾病相关[40-42]。然而，有关ST3GAL3突变和单核苷酸多态性在肿瘤中研究还很缺乏，有待进一步研究。
综上所述，本研究表明 ST3GAL3 在 ESCC 患者组织中高表达，其表达与ESCC患者TNM分期、肿瘤侵犯程度、淋巴结转移以及不良预后呈正相关。从机制上来说，ST3GAL3可能通过修饰相关黏附蛋白 （如整合素Integrin α5和β1等）的α⁃2，3⁃唾液酸化增强ECM介导的ESCC细胞铺展和黏附信号，进而促进细胞迁移。该研究将为预测ESCC的潜在临床标志物和治疗靶点提供理论依据。
利益冲突声明：
所有作者声明无利益冲突。
Conflict of Interests：
The authors declare no competing interests.
作者贡献声明：
杭庆雷负责该项目的构思设计以及科学指导。沈埝萱负责大部分实验研究并处理分析数据。孙陈晨、孔灵杰和祝梓豪负责实验试剂配制和实验条件摸索。郝鑫负责免疫组化实验。沈埝萱和杭庆雷主要负责文章撰写提供经费支持。
Author’s Contributions：
HANG Qinglei conceived and designed the project and provided scientific direction. SHEN Nianxuan performed and analyzed most of the experiments. SUN Chenchen，KONG Lingjie and ZHU Zihao contributed reagents and protocols. HAO Xin performed experiments on tissue microarrays. SHEN Nianxuan and HANG Qinglei wrote the manuscript，and allocated funding for this study.
