摘要
目的：从香烟烟雾中分离新的重要组分5-羟甲基-2-糠醛（5-hydroxymethyl-2-furfural，5-HMF），为评价其在吸烟所致呼吸系统损伤中的作用提供保证。方法：采用液液萃取与葡聚糖凝胶LH-20柱层析相结合的方法，对溶于三氯甲烷的香烟烟雾总提物（cigarette smoke extract，CSE）进行5-HMF 的提取。首先将溶于三氯甲烷的CSE用双蒸水进行两次液液萃取，将5- HMF从三氯甲烷转移至水相，随后采用葡聚糖凝胶LH-20进行5-HMF的分离。提取及分离过程的效果采用高效液相色谱-紫外检测法（high performance liquid chromatography-ultraviolet detection，HPLC-UV）进行分析。采用GraphPad Prism软件进行双因素方差分析（two-way ANOVA）和Tukey’s多重比较检验，以评估方法的稳定性和可重复性。结果：两次液液萃取可将CSE中约 92.18%的 5-HMF 转移至水相；葡聚糖凝胶 LH-20 可分离回收水相中约 94.88%的 5-HMF。3 次独立重复实验的变异系数为 8.53%，且双因素方差分析表明，虽然不同香烟样本间存在微小差异（P < 0.01），但5-HMF的洗脱分布规律高度一致（洗脱管数因素P < 0.0001），占总变异的97.04%，证实了方法具有良好的可重复性。从含量上计算，该方法最终能分离CSE中约89.55%的 5-HMF，且CSE中的尼古丁组分不会对5-HMF的分离造成干扰。结论：本研究实现了香烟烟雾中5-HMF的简单、快速、高效、稳定的分离，不仅为后续系统性研究香烟烟雾重要组分的毒效应提供物质和技术保证，也为香烟烟雾复杂基质中其他组分的分离制备提供了方法及思路。
关键词
Abstract
Objective：To separate a new important component 5 - hydroxymethyl - 2 -furfural（5 - HMF）in cigarette smoke，which provides a guarantee for evaluating its role in the respiratory system injury caused by smoking. Methods：A combination of liquid-liquid extraction and sephadex LH-20 column chromatography was used to extract and purify 5-HMF from the cigarette smoke extract （CSE）dissolved in chloroform. First，the total CSE was subjected to two consecutive liquid -liquid extractions with double-distilled water to transfer 5-HMF from the chloroform phase to the aqueous phase. Then，sephadex LH -20 was employed to separate 5-HMF from the aqueous phase. The efficiency of the extraction and separation processes were determined using high performance liquid chromatography-ultraviolet detection（HPLC-UV）. GraphPad Prism software was used for two-way analysis of variance（two-way ANOVA）and Tukey’s multiple comparisons test to evaluate the stability and reproducibility of the method. Results：The two-step liquid -liquid extraction transferred approximately 92.18% of 5-HMF from CSE to the aqueous phase. Sephadex LH -20 enabled the separation and recovery of approximately 94.88% of 5 -HMF from the aqueous phase. The coefficient of variation（CV）was 8.53% across three independent experiments. Two -way ANOVA indicated that although minor differences existed among different cigarette samples（P < 0.01），the elution profile of 5-HMF was highly consistent（tube number factor：P < 0.0001），accounting for 97.04% of the total variation，confirming the good reproducibility of the method. Based on the content calculation，this method achieved the separation of approximately 89.55% of 5-HMF from CSE，while the component of nicotine in CSE did not interfere with the separation of 5-HMF. Conclusion：This study realized the simple，rapid，efficient and stable separation and preparation of 5-HMF in cigarette smoke，which not only provided material and technical guarantee for the subsequent systematic study of the toxic effects of important components of cigarette smoke，but also provided methods and ideas for the separation and preparation of other components in the complex matrix of cigarette smoke.
吸烟不仅与慢性呼吸系统疾病和心血管疾病的发生密切相关[1-2]，同时也是多种癌症的主要诱因[3-4]。香烟烟雾是一种由气相成分与悬浮的固体颗粒及液滴共同组成的复杂气溶胶体系，包含7 000多种化学物质[5]。既往研究多聚焦于香烟烟雾混合物的整体毒性评估[6]。然而，若能鉴定其中的关键毒性组分并实现有效分离，对比分离组分与剩余组分的毒性差异，将有助于系统解析香烟烟雾的毒理学效应及机制，完善吸烟所致的健康危害资料，并为基于重要毒性组分制定更精准有效的防控策略提供科学依据。
5 ⁃羟甲基⁃2⁃糠醛（5⁃hydroxymethyl⁃2⁃furfural， 5⁃HMF）是一种呋喃类化合物，主要形成于食品热加工过程（如加热、烘焙）及美拉德反应中，广泛存在于干果、果汁、咖啡和烘焙食品等日常食品中[7-10]。现有研究表明，5⁃HMF对胃[11]、肝[12]、肾和神经系统[13] 均有一定毒性作用。近年来，本课题组率先发现5⁃HMF 亦存在于香烟烟雾中，且含量较高，提示5⁃HMF可能通过吸烟途径产生暴露风险。进一步研究表明， 5⁃HMF 可通过细胞色素P450 2A13酶代谢活化，表现出显著的呼吸毒性[14]，提示5⁃HMF可能是香烟烟雾中重要的毒性组分，值得进一步研究。
在香烟烟雾毒性评估中，大多数研究通常利用香烟烟雾总提物（cigarette smoke extract，CSE）构建暴露模型，多聚焦于 CSE 的混合毒性效应，较少涉及其重要毒性组分的分离及毒性评估。作为香烟烟雾中潜在的高风险毒性组分，虽然5⁃HMF含量可观且代谢活化后表现出显著毒性，但与香烟烟雾中其他重要组分相比毒性如何，5⁃HMF在整体香烟烟雾毒性中的具体贡献等尚不清楚。因此，需要建立高效、批量从 CSE 中提取和纯化 5⁃HMF 的方法，以满足细胞、动物染毒实验需要。
葡聚糖凝胶LH⁃20柱层析结合了凝胶过滤、分配色谱及吸附层析的优势，具有较高的分辨率，能够有效分离复杂混合物。葡聚糖凝胶LH⁃20作为经典的天然产物、多肽及复杂样品分离纯化的方法已得到了广泛应用[15-17]。曾有研究报道采用葡聚糖凝胶LH⁃20从腌制食品中成功分离纯化出5⁃HMF[18]，这为本研究提供了重要的方法学参考。CSE基质复杂，本研究拟基于液液萃取和葡聚糖凝胶LH⁃20构建一种简单、快速、高效、稳定的5⁃HMF分离体系，以便为后续系统性研究香烟烟雾重要组分5⁃HMF的毒性提供技术保证。
1 材料和方法
1.1 材料
5 ⁃HMF 标准品（纯度 98%，北京白灵威公司），尼古丁标准品（纯度 98%，常州坛墨质检科技股份有限公司），甲醇（Tedia 公司，美国），三氯甲烷（南京化学试剂股份有限公司），以上试剂皆为色谱纯；某品牌香烟（南京江苏中烟工业有限责任公司）；葡聚糖凝胶 LH⁃20（北京瑞达恒辉科技发展有限公司）。
大气采样仪 QC ⁃4S（北京科安劳保新技术公司）；MD200⁃1氮吹仪（杭州奥盛仪器有限公司）；棕色包氏气体采样管和具砂板层析柱（盐城江苏三爱思科学仪器有限公司）；高效液相色谱仪Prominence LC⁃ 20A（岛津公司，日本）；0.45 μm过滤器（北京兰杰柯科技有限公司）。
1.2 方法
1.2.1 标准溶液配制
将规格为5 mg的标准品溶于5 mL甲醇，制成浓度为1 mg/mL的储备液。取部分5⁃HMF储备液用甲醇逐级稀释，配制成浓度分别为 10、20、50、100、 200、500 μg/mL 的溶液。将购买的浓度为 1 mg/mL 尼古丁标准品用甲醇逐级稀释，配制成浓度为100、 200、400、600、800 μg/mL的溶液。
1.2.2 香烟烟雾抽提物的制备
将大气采样器、棕色包氏气体采样管和香烟滤嘴用橡胶管依次连接起来，组装成香烟烟雾串联抽吸装置，将10 mL三氯甲烷作为吸收液加入包氏气体采样瓶中，以尽量多地收集香烟烟雾有机组分。设定大气采样仪的流速为75 mL/min，控制在5 min左右匀速抽完每支烟，一次实验抽吸一包烟（20支）。将吸收液置于氮气仪中吹干，吹干后加入1 mL三氯甲烷溶液复溶，制成CSE。
1.2.3 CSE的液液萃取
将溶解于三氯甲烷的 CSE 与双蒸水以 1∶1 体积进行液液萃取，收集水相。重复上述操作 1 次，合并两次水相萃取液并经 0.45 μm 水相过滤器过滤后待用。
1.2.4 葡聚糖凝胶LH⁃20的分离方法
准确称量3 g葡聚糖凝胶LH⁃20放入烧杯中，随后加入30 mL甲醇并置于4℃冰箱过夜溶胀。第2天将溶胀好的葡聚糖凝胶 LH⁃20进行装柱填充，此过程在 1~2 min 内完成。打开具砂板层析柱开关，将高出凝胶柱截面的甲醇过滤除去，待到甲醇液面下降至高于凝胶柱截面约1 cm时关闭开关。将提取的含有 5⁃HMF 的水相组分经玻璃棒进行引流，缓慢匀速地加入到具砂板凝胶柱中，待水相组分全部进入柱子后，打开具砂板层析柱开关进行洗脱。第1毫升洗脱液中水和甲醇的比例为9∶1，第2毫升洗脱液中水和甲醇的比例为8∶2，后续逐渐增加甲醇的比例进行洗脱，直至用 100%甲醇并随后一直用 100%甲醇进行洗脱，共收集 30 管洗脱液，每管 1 mL，分别记为 T1、T2、T3······T30。刚开始洗脱速度较为缓慢，控制6~7 min收集1管（1 mL），当洗脱液为 100%甲醇时，可将具砂板层析柱的开关完全打开，加快分离速度，约每3 min收集1管，完成1包香烟的CSE分离约需2.5 h。将分离出来的30管洗脱液样品于4℃冰箱避光保存以待测。
1.2.5 5⁃HMF和尼古丁的高效液相色谱⁃紫外检测法（high performance liquid chromatography⁃ultraviolet detection，HPLC⁃UV）测定
色谱柱：EclipseXDB⁃C18（4.6 mm×250.0 mm， 5 μm），进样量为20 μL，具体洗脱程序见表1，使用紫外吸收检测器。5⁃HMF的检测波长为284 nm，尼古丁的检测波长为260 nm。
表1HPLC洗脱程序
Table1Elution program of HPLC
1.3 统计学方法
实验数据以均值±标准差（）表示。采用 GraphPad Prism 9.0 软件进行双因素方差分析（two⁃ way ANOVA），分析管数（行因素）和香烟包别（列因素）对 5⁃HMF 含量的影响，显著性水平设定为α= 0.05。若存在显著主效应，进一步进行Tukey’s多重比较检验。P <0.05为差异有统计学意义。
2 结果
2.1 CSE中5⁃HMF含量测定
选择南京地区主流消费香烟品牌制备CSE样品。通过HPLC⁃UV检测，5⁃HMF的出峰时间为7.35 min （图1A），尼古丁的出峰时间为10.43 min（图1B）。利用 5⁃HMF 和尼古丁标准品溶液，绘制峰面积⁃浓度标准曲线，标准曲线的决定系数（R2）均>0.99（图1C、 D）。CSE的色谱图见图2，3次重复实验显示单包香烟的 CSE 样品中 5⁃HMF含量为（2.01±0.04）mg。此外，分别检测了 3 种低焦油（5 mg）和 4 种高焦油 （10 mg）品牌香烟中 5⁃HMF 的含量，发现多集中在 1.59~2.77 mg，与焦油含量关系不大。可见 5⁃HMF 在香烟燃烧产物中稳定存在且具备可量化提取的潜力。
2.2 CSE中5⁃HMF的提取
2.2.1 基于5⁃HMF标准品对液液萃取条件进行优化
将 5⁃HMF 标准品溶于三氯甲烷并与双蒸水按 1∶1（V∶V）混合，充分振荡后分层，分别收集水相和三氯甲烷部分，此为单次液液萃取。在单次液液萃取的基础上，向三氯甲烷中再次加入双蒸水，充分振荡分层后收集水相，并与第1次收集的水相合并，此为两次液液萃取。采用HPLC分别检测单次和两次液液萃取后的三氯甲烷及水相部分。结果显示，单次液液萃取能将约75.05%的5⁃HMF从三氯甲烷转移至水相（图3A、B，表2）；两次液液萃取能将9 3.43%的5⁃HMF萃取到水相（图3C、D，表2），表明两次液液萃取基本能将三氯甲烷中的5⁃HMF 提取至水相中。因此，研究选择两次液液萃取对CSE中的5⁃HMF进行提取。
图15⁃HMF和尼古丁的标准色谱图及峰面积⁃浓度标准曲线
Figure1Standard chromatograms and curves of 5⁃HMF and nicotine
图2CSE的色谱图
Figure2Chromatogram of CSE
2.2.2 CSE中5⁃HMF提取效率的验证
采用双蒸水对CSE进行两次液液萃取，并通过 HPLC 进行检测。结果显示，两次液液萃取能够将 CSE中92.18%的5⁃HMF高效转移至水相中（图4，表3），这一结果与前述5⁃HMF标准品的两次萃取数据基本一致。此外，定量分析表明，经过两次液液萃取后，水相中的5⁃HMF含量为1.89 mg，而三氯甲烷中剩余的5⁃HMF含量仅为0.16 mg（表3）。
2.3 CSE中5⁃HMF的分离
通过对水相和三氯甲烷的色谱图（图4）比对分析发现，在 8~12 min 时间段内，三氯甲烷色谱图的基线明显抬高，这表明在高效提取5⁃HMF的同时，大部分有机物仍保留在三氯甲烷中，从而实现了 5⁃HMF的初步净化。单包香烟CSE经水相提取后的部分，经葡聚糖凝胶LH⁃20反向洗脱，共收集30管洗脱液（1 mL/管）。为验证方法稳定性，在相同实验条件下对另2包香烟的CSE水相组分进行重复实验，累计收集90管洗脱液样品，采用HPLC对90管样品进行检测，分析5⁃HMF的洗脱分布规律。
经检测，第1包香烟的CSE 水相组分分离出的 30管样品中，5⁃HMF色谱峰从第8管开始陆续出现、直至第 16 管终止，5⁃HMF 主要富集于第 9~14 管中。需特别说明的是，因仪器检测浓度的限制，第 9~12管样品经4倍稀释、第13管样品经2倍稀释后检测，其余管直接进样。为验证方法的稳定性，在相同条件下对另2包香烟CSE水相分离出的样品进行检测，检测结果与第1包香烟结果相似。3次独立分离实验的检测数据显示，5⁃HMF洗脱分布规律高度一致，均主要集中于第 9~14 管（图5，表4），故将第 9~14 管合并为 5⁃HMF 段。根据峰面积计算纳入 5⁃HMF段的比例为：（T9+T10+T11+T12+T13+T14）/ （T8+T9+T10+T11+T12+T13+T14+T15+T16）×100%=9 4.88%。3次重复独立实验显示5⁃HMF段的5⁃HMF 峰面积变异系数为8.53%。
图35⁃HMF标准品液液萃取后的色谱图
Figure3Chromatogram of standard 5⁃HMF after liquid⁃liquid extraction
表2液液萃取后水相和三氯甲烷中5⁃HMF的峰面积比较（n=3）
Table2Comparison of peak areas of 5⁃HMF in aqueous and chloroform phases after liquid⁃liquid extraction（n=3）
图4CSE经两次液液萃取后的色谱图
Figure4Chromatograms of CSE after double liquid⁃liquid extraction
表3CSE经两次液液萃取后水相和三氯甲烷中5⁃HMF的峰面积及含量（n=2，）
Table3Peak area and content of 5 ⁃ HMF in aqueous phase and chloroform of CSE after double liquid⁃ liquid extraction（n=2，）
同时为评估分离方法在不同香烟样本间的一致性，对 3 包香烟的 5⁃HMF 洗脱数据进行了双因素方差分析。结果显示，管数因素对 5⁃HMF含量的影响极显著（P <0.000 1），占总变异的97.04%； 香烟包别因素也具有显著性（P=0.007 2），但仅占总变异的1.37%（表5）。Tukey’s多重比较表明，第1包香烟（A）与第2包（B）、第3包（C）之间差异有统计学意义（P <0.05），而第2包与第3包之间差异无统计学意义（P >0.05，表6）。这表明尽管不同香烟样本间存在微小差异，但5⁃HMF的洗脱趋势高度一致，方法具有良好的可重复性。
2.4 5⁃HMF总体分离效果的评价
2.4.1 5⁃HMF的总体分离效率
HPLC⁃UV 测定单包香烟CSE中5⁃HMF的含量为（2.01±0.04）mg，分离制备体系最终获得的单包香烟5⁃HMF的含量为（1.80±0.17）mg。因此，5⁃HMF的总体分离效率约为89.55%，表明该分离体系具有较高的效率。
2.4.2 尼古丁与5⁃HMF的有效分离
为检验尼古丁是否干扰5⁃HMF提取，对3个批次分离出的90管洗脱液进行了尼古丁检测。结果发现尼古丁主要富集于第 19~20 管（图6，表7），双因素方差分析显示，管数因素对尼古丁含量的影响极显著（P <0.005），占总变异的85.18%（表8），表明尼古丁在特定管数中被集中洗脱，模式一致。至关重要的是，香烟包别因素差异无统计学意义（P=0.682 9），其贡献的变异仅占1.77%（表8）。说明本方法对尼古丁的分离具有高度的稳定性和可重复性。且5⁃HMF 富集于第9~14管，二者无重叠，故尼古丁并未对5⁃HMF 的分离过程造成干扰。
3 讨论
本研究利用液液萃取联合葡聚糖凝胶LH⁃20，成功建立了批量、稳定、高效的香烟中5⁃HMF的分离方法。通过3次独立分离实验验证，5⁃HMF的洗脱分布规律呈现高度一致性：5⁃HMF主要富集于第 9~14 管洗脱液段，该区段 5 ⁃ HMF 比例达到了 94.88%，表明分离过程收集到了绝大部分的5⁃HMF。值得注意的是，3 次重复实验中 5⁃HMF 段的特征峰面积的变异系数仅为 8.53%，显示了该方法的稳定性和可重复性。在分离效率评估方面，单包香烟经本体系分离获得的 5⁃HMF 含量为（1.80± 0.17）mg，提取率达 89.55%，展现出良好的分离效率。统计分析进一步证实，虽然可能因为前期制备CSE及进行液液萃取过程中出现的误差，导致3包香烟样本间存在微小差异（香烟包别因素显著但贡献率低），但 5⁃HMF 的洗脱分布高度一致（管数因素极显著），说明本方法在不同香烟样本间具有较好的稳定性和可重复性。实验数据表明，该分离方法不仅实现了对香烟中 5⁃HMF 的高效提取，同时保证了分离过程的可重复性，为后续相关研究提供了可靠的技术支持。
图5经葡聚糖凝胶LH⁃20分离后不同收集管中5⁃HMF的色谱图
Figure5Chromatograms of 5⁃HMF in different fractions after sephadex LH⁃20 separation
表4经葡聚糖凝胶LH⁃20分离后不同收集管中5⁃HMF峰面积、比例及含量（n=3）
Table4Peak area，proportion and content of 5⁃HMF in different fractions after sephadex LH⁃20 separation（n=3）
表53 包香烟 5⁃HMF 洗脱分布数据的双因素方差分析结果
Table5Two⁃way ANOVA results of 5⁃HMF elution data among three cigarette packs
表6Tukey’s多重比较结果（香烟包别）
Table6Tukey’s multiple comparisons test（cigarette packs）
A，B，and C represent different cigarette packs.
前期研究发现，无论是 3R4F 标准参考香烟还是中国品牌香烟中的5⁃HMF含量大致相当，故采用南京某主流品牌香烟进行5⁃HMF 的分离提取。因溶于三氯甲烷的 CSE 呈现浓稠、深褐色状态，组分非常复杂[19]，故首先对 CSE 中的 5⁃HMF 进行粗提。考虑到5⁃HMF易溶于水相，而液液萃取则能利用目标物质在两种互不相溶溶剂中的溶解度差异进行重新分配，并且液液萃取操作简单、快速[20-21]。因此，本研究选择两次液液萃取的方法粗提 CSE 中的 5⁃HMF，并发现两次液液萃取能够将 CSE 中 92.18%的5⁃HMF高效转移至水相中。
由于经水相提取的色谱图在出峰时间7 min之后仍存在除5⁃HMF以外的显著杂质峰，表明液液萃取在提取5⁃HMF的同时，也将其他易溶于水相的化合物一并提取出来。因此，为提高分离纯度，有必要对水相提取部分进行进一步的纯化处理。葡聚糖凝胶LH⁃20是一种常用的凝胶过滤层析介质，由交联葡聚糖经羟丙基化修饰而成。它结合了分子筛分离和吸附层析的特性，适用于分离和纯化多种有机化合物，尤其是黄酮类、生物碱、萜类等天然产物、多肽、小分子药物等[22-24]。其适用范围广，兼容多种溶剂，分离效果好，分辨率高，操作简单，可重复使用。尼古丁是香烟中的传统组分，在香烟中的含量并不低且易溶于水[25]。为检验提取及分离出的5⁃HMF组分中是否存在尼古丁，对3批次分离出的洗脱液进行了尼古丁检测。发现尼古丁主要富集于第19~20管，与5⁃HMF段无重叠，表明尼古丁并未对5⁃HMF的分离过程造成干扰。
鉴于5⁃HMF在香烟烟雾中的高含量及经代谢后的高毒性，为更好地评价 5⁃HMF 在香烟烟雾中的毒性作用，本研究基于液液萃取结合葡聚糖凝胶LH⁃20，构建了CSE中5⁃HMF的批量分离制备方法，该方法在保证量、效率及稳定性的同时，排除了香烟中重要组分尼古丁的干扰，为后续系统性地评价香烟烟雾中5⁃HMF的毒性提供了技术支持，满足后续动物染毒实验的需要。此外，不同于中药和食品，从香烟烟雾中分离组分更有挑战和意义，本研究建立的组分分离方法，可为相关混合物（如PM2.5） 的毒性评价及健康危害评估提供技术方法，也可为系统挖掘混合物中的关键毒性组分提供参考。当然，香烟烟雾中的组分很多，本方法仅分离了5⁃HMF和尼古丁，后续将在进一步优化分离体系的基础上，对其他潜在的毒性组分进行分离与检测，以开展对复杂混合物的毒性研究及潜在的健康风险评估。同时也将持续改进现有方法，致力于开发更简便、高效的5⁃HMF及其他重要毒性单体组分的分离技术。
图6经葡聚糖凝胶LH⁃20分离后不同收集管中尼古丁的色谱图
Figure6Chromatograms of nicotine in different fractions after sephadex LH⁃20 separation
表7经葡聚糖凝胶LH⁃20分离后不同收集管中尼古丁峰面积、比例及含量（n=3，）
Table7Peak area，proportion，and content of nicotine in aqueous phase after sephadex LH⁃20 separation （n=3，）
表83包香烟中尼古丁洗脱数据的双因素方差分析结果
Table8Two⁃way ANOVA results of nicotine elution data among three cigarette packs
利益冲突声明：
虽然作者单位与期刊编辑部同隶属南京医科大学，但无利益冲突。
Conflict of Interests：
Although the author’s affiliation and the editorial depart⁃ ment of journal belong to Nanjing Medical University，there is no conflict of interests.
作者贡献声明：
段名秀负责实施研究、分析数据和起草论文；张代为负责样品检测和数据分析；彭梦凡负责实验准备及仪器维护工作；王丽、王守林负责研究设计、文章修改及项目资助。
Author’s Contributions：
DUAN Mingxiu was responsible for conducting research， analyzing data，and drafting the manuscript；ZHANG Dai⁃ wei was responsible for sample testing and statistical analysis； PENG Mengfan was responsible for experimental preparation and instrument maintenance；WANG Li and WANG Shoulin were responsible for research design，article revision，and project funding.
