动脉粥样硬化（atherosclerosis，AS）是一种血脂异常及血管壁成分改变的慢性炎症病变^[1]，其脂质代谢紊乱累及肝脏造成脂肪变性，近年来广受关注^[2]。尾加压素Ⅱ（urotensin Ⅱ，UⅡ）是由11个氨基酸残基组成的生长抑素样神经环肽，参与调节心血管、免疫、消化、泌尿等系统疾病的发生发展^[3]。UⅡ主要通过与其特异性G蛋白偶联受体UT结合构成UⅡ/UT系统在多器官中发挥生物学作用^[4]。有研究已证实， UⅡ/UT系统与肝内炎症损伤存在密切联系^[5-6]。本课题组前期研究发现，UⅡ/UT系统可通过C反应蛋白（C⁃reactive protein，CRP）、单核趋化蛋白⁃1（mono⁃ cyte chemotactic protein⁃1，MCP⁃1）以及白细胞介素6 （interleukin⁃6，IL⁃6）参与AS大鼠体内炎症反应的发生^[7-8]，同时诱导AS大鼠肝损伤，发生脂肪变性^[9]，其具体调控机制尚有待阐明。近年研究发现，信号转导与转录激活因子3（signal transducer and activator of transcription 3，STAT3）可介导机体的炎症反应和细胞增殖诱导AS的发生^[10]。此外，STAT3信号通路在非酒精性脂肪肝的发生发展过程中发挥关键作用^[11-12]。为进一步探究AS大鼠脂肪肝中UⅡ/UT系统与STAT3之间的关系，本研究采用UⅡ受体拮抗剂Urantide阻断UⅡ/UT信号通路，观察了AS大鼠肝脏中STAT3的表达水平，初步探讨了UⅡ/UT系统对STAT3的作用机制，借以深入阐明UⅡ/UT系统对AS大鼠造成肝脂肪变性的反应机制。

1 材料和方法

1.1 材料

3周龄雄性SPF级Wistar大鼠30只，体重180~200g，购于北京维通利华实验动物技术有限公司，实验动物使用许可证号：SCXK（京）⁃2016⁃0011。 Urantide（苏州强耀生物公司）；维生素D₃（VD₃，哈尔滨市华晟科技动物药品厂）；胆固醇、胆酸钠（Sigma公司，美国）；丙硫氧嘧啶片（上海朝晖药业有限公司）；兔抗大鼠p⁃STAT3抗体（CST公司，美国）；兔抗大鼠β⁃actin抗体、HRP标记山羊抗兔二抗（Bioworld公司，美国）；TRIzol裂解液、RIPA蛋白裂解液、Brad⁃ ford组织蛋白浓度测定试剂盒、超敏ECL化学发光试剂盒（上海碧云天生物技术有限公司）；TIAN⁃ Script cDNA第一链合成试剂盒、SuperReal PreMix SYBR Green试剂盒、DAPI染液、FITC标记二抗（北京天根生化科技有限公司）。

1.2 方法

1.2.1 实验动物分组及处理

30只雄性Wistar大鼠适应性饲养1周[恒定温度（22±2）℃，相对湿度（50±10）%，正常摄食及饮水]，按照随机数字表随机分成3组（每组10只）：正常组、AS组、Urantide组。根据参考文献方法制备AS大鼠模型^[13]：AS组、Urantide组饲以特制高脂饲料（基础饲料80.8%，胆固醇3.5%，胆酸钠0.5%，丙硫氧嘧啶0.2%，猪油10%，白糖5%），并连续3d给予每只大鼠腹腔注射VD₃ 150 μg/（kg·d）。于第4周，随机选取1只模型大鼠，进行血脂指标检测及病理学检测，以判断造模是否成功。模型复制成功后，Uran⁃ tide组尾静脉注射Urantide30 μg/（kg·d），正常组和AS组尾静脉注射等体积生理盐水，连续给药2周。大鼠禁食12h后取材。分别称取体重及肝重，计算肝系数（肝系数=肝重/体重×100%）。胸主动脉取血，全自动生化分析仪检测大鼠血清中丙氨酸氨基转移酶（alanine aminotransferase，ALT）、天门冬氨酸氨基转移酶（aspartate aminotransferase，AST）的含量。本研究所有大鼠实验均严格遵循动物实验“3R” 原则，按照中华人民共和国国家标准《实验动物福利伦理审查指南》（GB/T27416⁃2014）执行。

1.2.2 HE染色法

将大鼠胸主动脉、肝组织于4%多聚甲醛固定后经梯度乙醇脱水、二甲苯透明、浸蜡、石蜡包埋后制备石蜡切片，经二甲苯脱蜡、梯度乙醇水化后，常规HE染色，光镜下观察各组大鼠的病理学变化。

1.2.3 RT⁃qPCR检测

TRIzol法提取肝组织总RNA，紫外分光光度计进行定量，TIANScript cDNA第一链合成试剂盒合成cDNA，SuperReal PreMix SYBR Green试剂盒分别检测STAT3、β⁃actin mRNA的CT值，基因检测引物序列见表1，扩增条件：94℃ 5min；94℃ 30s，60℃ 34s， 40个循环；做熔解曲线。以STAT3C_T值与β⁃actinmRNA C_T 值的差值为ΔC_T，采用2^-ΔCT 法计算各组mRNA的相对表达量。以上操作均按照试剂盒说明书进行操作。

1.2.4 免疫印迹检测

采用RIPA裂解液及匀浆仪提取肝组织的总蛋白，BCA蛋白浓度测定试剂盒测定蛋白含量。45 μg蛋白上样于SDS⁃PAGE分离、转膜和5%脱脂奶粉溶液室温封闭1h，一抗p⁃STAT3（1∶800）、STAT3（1∶ 1 000）、β⁃actin（1∶10 000）于4℃摇床孵育过夜；洗膜后，加入二抗（1∶5 000），室温孵育1h，洗膜后用超敏ECL化学发光试剂盒显影。Image J软件测定蛋白条带灰度值，计算蛋白相对表达水平。

1.2.5 组织免疫荧光法检测

取制备好的肝组织石蜡切片样本，经二甲苯脱蜡、梯度乙醇水化后，抗原修复，10%山羊血清封闭，一抗p⁃STAT3（1∶1 000）4℃孵育过夜；洗片后，暗室中滴加FITC标记二抗（1∶1 000），37℃孵育1h，弃去二抗，加入DAPI染液，孵育45min，洗片，防荧光淬灭剂封片后于荧光显微镜下观察。每组选3张飞片，每张飞片选取3个不同视野进行拍照。Image⁃ Pro Plus 6.0软件计算免疫荧光阳性细胞的平均光密度值，取平均值作统计学分析。

1.3 统计学处理

实验结果数据采用SPSS 21.0统计软件进行分析，计量资料以均数±标准差（$\stackrel{-}{x}$ ± s）表示，均符合正态分布，采用单因素方差分析进行组间比较，以P< 0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 大鼠胸主动脉及肝组织病理特征

如图1所示，正常组胸主动脉血管内皮细胞排列整齐，中膜弹力纤维层结构完整清晰，血管平滑肌细胞整齐排列，内膜、中膜、外膜分界清晰完整； AS组血管内皮细胞显著损伤，出现钙化，中膜弹力纤维断裂，呈现典型的AS病理特征；Urantide组血管内皮细胞损伤恢复明显，钙化显著消失，中膜平滑肌细胞及弹力纤维恢复尚可。相应地，正常组肝细胞形态结构正常，肝小叶结构，正常肝索排列均匀规则； AS组肝细胞明显肿胀变形，肝索排列紊乱，肝小叶界限不清晰，细胞质中出现大量空泡样脂滴，部分细胞核偏向细胞一侧，为典型的肝细胞脂肪变性；Urantide组肝细胞形态明显恢复正常，肝索排列尚可，肝小叶结构形态基本趋于正常组。这提示VD₃联合特制高脂饲料可以成功诱导大鼠AS和脂肪肝发生，而且Urantide可有效减轻AS病变及肝脂肪变性。

2.2 大鼠肝系数和ALT、AST水平

如图2所示，与正常组相比，AS组大鼠肝系数显著升高（P< 0.05）；Urantide组大鼠肝系数较AS组显著降低（P< 0.05），较正常组显著升高（P< 0.05）。相应的，与正常组相比，AS组大鼠血清中ALT、AST水平显著升高（P< 0.05），Urantide组血清中ALT、AST较AS组显著降低（P< 0.05），较正常组无显著差异（P> 0.05）。这提示AS组大鼠肝脏发生了严重的肝实质性损伤和炎症反应，而Urantide可有效保护肝脏。

2.3 大鼠肝组织中STAT3 mRNA的表达水平

如图3所示，RT⁃qPCR检测结果显示，各组间大鼠肝组织中STAT3mRNA的表达水平无显著变化 （P> 0.05，n=3）。提示VD₃联合特制高脂饲料处理以及Urantide对大鼠肝组织中STAT3的转录水平均没有影响。

2.4 大鼠肝组织中STAT3、p⁃STAT3蛋白表达水平

如图4所示，免疫印迹检测结果显示，与正常组相比，AS组大鼠肝组织中p⁃STAT3蛋白表达显著升高（P< 0.05），STAT3蛋白表达无显著差异（P> 0.05）；与AS组相比，Urantide组大鼠肝组织p ⁃ STAT3蛋白表达显著降低（P< 0.05），STAT3蛋白表达无显著变化（P> 0.05）。这提示VD₃联合特制高脂饲料处理可显著活化大鼠肝组织中p⁃STAT3的表达，Urantide可抑制p⁃STAT3的表达水平，而对大鼠肝组织中STAT3的蛋白表达水平没有影响。

2.5 免疫荧光检测大鼠肝细胞中p⁃STAT3 的表达水平

如图5所示，免疫荧光结果显示，与正常组大鼠肝细胞中p⁃STAT3阳性染色荧光强度（5.06±1.01）相比，AS组荧光强度（1 504.78±241.19）显著增加（P< 0.05）。与AS组相比，Urantide组荧光强度（159.90± 22.69）显著降低（P< 0.05）。

3 讨论

肝脏被视为脂质代谢的重要场所，不但其病变导致的脂质代谢紊乱是脂肪肝的发病基础，而且其诱导的高脂蛋白血症是AS发生的最基本的危险因素^[14]。随着生活水平的不断提高，高脂饮食逐渐成为危害人类健康的关键因素，近年来非酒精性脂肪肝的发病率呈明显上升趋势^[15]。本课题组在前期体内研究中发现，用高脂饮食联合注射VD₃的方法复制的AS大鼠不但发生典型的AS病变，而且均伴有明显的脂肪肝^[9]；进一步研究发现，AS大鼠血清中ALT、AST水平显著升高，提示AS大鼠肝脏出现严重的肝功能障碍及急性炎症损伤反应；与此同时肝内UⅡ/UT系统被激活，采用UⅡ受体拮抗剂Ura⁃ ntide对AS大鼠进行治疗后，肝内UⅡ/UT表达水平被显著抑制，同时肝脏肝功能明显恢复^[16-17]。有研究表明，UⅡ/UT系统可诱导小鼠肝脏“内皮炎症”，在急性肝衰竭中发挥关键作用^[18]。这提示，UⅡ/UT系统诱导的炎症反应可能介导了AS大鼠脂肪肝的发生，其在肝脏中激活可能是肝脏损伤的主导因素。

本研究发现，AS大鼠脂肪肝组织中STAT3的基因和蛋白的表达水平较正常大鼠均无显著变化，而p⁃STAT3蛋白表达显著升高。STAT3是信号转导与转录激活蛋白家族成员，可被受体相关激酶磷酸化，然后形成同源二聚体或异源二聚体易位入核，作为转录激活因子介导多种基因的表达。STAT3参与调节多器官的病理生理过程，在细胞增殖、血管生成、癌症、脂质合成、细胞免疫等过程中发挥关键作用^[19]。大量研究发现，STAT3信号通路可引起组织细胞的炎症反应和细胞增殖，诱导AS^[10，20-21]、非酒精性脂肪肝^[11-12] 等疾病的发生，其蛋白及磷酸化水平表达升高。由此，笔者推测AS大鼠肝组织中p⁃STAT3蛋白表达水平升高可能与肝组织炎症反应相关，UⅡ/UT系统可能通过激活STAT3信号蛋白促进炎症因子表达诱导脂肪肝的发生发展。

为验证以上推论，本研究采用Urantide阻断U Ⅱ/UT系统。实验结果发现，Urantide显著抑制了p⁃ STAT3的表达水平，而对STAT3的基因表达和蛋白稳定性没有显著影响。这提示AS大鼠肝内STAT3信号通路经UⅡ/UT系统活化，诱导肝脏发生炎症反应损伤肝细胞，促进脂肪肝的发生发展。同时Uran⁃ tide可通过抑制STAT3介导的炎症反应，使大鼠肝脏的脂质代谢功能得以恢复，进而延缓脂肪肝的进一步发展。进一步的免疫荧光实验也证实了这一推论，Urantide可显著降低大鼠肝细胞中p⁃STAT3水平，抑制STAT3的活化水平。

综上所述，UⅡ受体拮抗剂Urantide可通过抑制STAT3介导的炎症反应，减轻肝细胞的损伤，进而缓解AS大鼠的肝脂肪变性。而炎症反应中UⅡ/UT系统激活STAT3信号通路的具体分子作用机制仍需进一步研究。总之，本研究结果进一步表明，Uran⁃ tide在治疗AS的同时，还可通过阻断STAT3这一信号途径来治疗脂肪肝。

参考文献