-
宫颈癌是妇科常见的恶性肿瘤之一，发病率在我国女性恶性肿瘤中位居第二。宫颈癌的发生、发展与人乳头瘤病毒（human papillomavirus，HPV）的感染密切相关[1]。不同的HPV亚型具有不同的致病性。目前已分离出HPV亚型120余种，其中常见高危型有18种。临床上常用的HPV DNA基因分型检测能反映宫颈上皮细胞的病毒种类和载量，但对病毒的活动程度无法知晓。研究发现，高危型HPV E6/E7mRNA可反映致癌基因E6/E7的活动度，其过度表达是宫颈癌及癌前病变发生的关键[2]。本研究通过比较HPV DNA基因分型检测和HPV E6/E7mRNA检测结果，评估两种方法在宫颈癌早期筛查中的诊断价值。
-
1 对象和方法
-
1.1 对象
-
选取2018年1月1日—12月31日在南京医科大学附属妇产医院妇科、宫颈科、妇女保健门诊就诊，并自愿接受宫颈部位HPV DNA基因分型检测及HPV E6/E7mRNA检测的女性，年龄18~88岁。其中，接受HPV DNA基因分型检测的样本共29 081例，接受E6/E7mRNA检测的样本共22 562例。本研究经医院伦理委员会批准，所有被检者均知情同意。
-
1.2 方法
-
1.2.1 标本采集
-
标本使用专用HPV采样刷，由门诊医生取宫颈脱落细胞储存于有专用细胞保存液的取样管中， 4℃冰箱保存，1周内检测。
-
1.2.2 HPV DNA分型检测
-
使用亚能生物技术（深圳）有限公司生产的人乳头瘤病毒（HPV）基因分型检测试剂盒及人乳头瘤病毒分型基因芯片检测系统，对23种HPV基因型进行检测，其中包括18种高危型（HPV16、HPV18、 HPV31、HPV33、HPV35、HPV39、HPV45、HPV51、 HPV52、HPV53、HPV56、HPV58、HPV59、HPV66、 HPV68、HPV73、HPV83、HPV82）和5种低危型 （HPV6、HPV11、HPV42、HPV43、HPV81）。检测过程严格按照试剂盒及检测系统说明书进行，包括标本DNA提取、聚合酶链反应（polymerase chain reac⁃ tion，PCR）、导流杂交。根据芯片上HPV基因型分布的相应位点进行判读。
-
1.2.3 HPV E6/E7 mRNA检测
-
使用美国豪洛捷公司（Hologic）研发的Aptima HPV（14种高危亚型）试剂盒、Aptima HPV 16、HPV 18/45分型检测试剂盒及Panther一体化检测平台进行HPV E6/E7mRNA检测。检测过程分为两个步骤，第一步：使用Aptima HPV（14种高危亚型）试剂盒对14种高危型（HPV16、HPV18、HPV31、HPV33、 HPV35、HPV39、HPV45、HPV51、HPV52、HPV56、 HPV58、HPV59、HPV66、HPV68）E6/E7mRNA进行检测；第二步：使用Aptima HPV 16、HPV18/45分型检测试剂盒对第一步检测结果阳性的样本进行HPV16、HPV18/45分型检测。检测操作过程严格按照试剂盒及检测系统说明书进行（该检测过程为全自动、一体化过程，仅需将检测试剂、样本放入后机器运行检测程序即可）。检测结果判读：系统自动读出“阴性、HPV 16型阳性、HPV 18/45型阳性、其他阳性”4种结果。
-
1.3 统计学方法
-
应用SPSS16.0软件进行统计分析，以百分率作为HPV感染的统计描述。两样本间率的比较采用卡方检验，P ＜0.05为差异有统计学意义。
-
2 结果
-
2.1 两种检测方法检测结果分析
-
在接受HPV DNA基因分型检测的29 081例样本中，共检出阳性例数8 602例，HPV阳性率为29.57%（8 602/29 081），其中高危型阳性例数7 425例，高危型阳性率为25.53%，占86.32%（7 425/8 602）。检测的23种HPV亚型均有检出，高危型HPV感染前5名依次为HPV52、HPV16、HPV53、 HPV58、HPV51，占阳性例数百分比分别为22.13%（1 904/8 602）、14.32%（1 232/8 602）、13.22%（1 137/8 602）、10.63%（914/8 602）、9.13%（785/8 602）。在接受E6/E7mRNA检测的22 562例样本中，共检出阳性病例2 840例，高危型阳性率为12.59%（2 840/22 562），其中HPV16阳性患者557例，占19.61%（557/2 840），HPV18/45阳性患者198例，占6.97%（198/2 840），其他类型阳性患者2 091例，占73.63%（2 091/2 840）。具体检测结果见表1。
-
2.2 不同年龄段高危型阳性率比较
-
采用HPV DNA基因分型和E6/E7mRNA检测结果按不同年龄段分组，各组检测例数和高危型阳性例数详见表2。HPV DNA基因分型检测，高危型阳性率最高峰出现在＜25岁年龄段；HPV E6/E7mRNA检测，高危型阳性率排名前二的分别是≥65岁年龄段、55~＜65岁年龄段。卡方检验结果显示，两种检测方法中，在不同年龄段间高危型阳性率的差异均有统计学意义（P ＜0.05）；但各年龄段间两两比较，两种检测方法中，55~＜65岁年龄段与≥65岁年龄段间高危型阳性率差异均无统计学意义（P ＞ 0.05）。
-
*：统计不同亚型感染时多重感染者重复计数。
-
2.3 不同年龄段两种检测方法HPV16、HPV18/45 阳性率比较
-
不同年龄段，两种检测方法的HPV16、HPV18/45阳性例数见表3。卡方检验结果显示，除55~＜65岁年龄段、≥65岁年龄段，其余年龄段两种检测方法检测的HPV16、HPV18/45阳性率差异均有统计学意义（P ＜0.05）。
-
3 讨论
-
HPV是一组无包膜的小DNA病毒，属乳头瘤病毒科。持续高危型HPV感染是导致宫颈癌的主要原因，其分型检测在宫颈癌筛查中具有举足轻重的作用[3]。
-
*：包括单纯高危型阳性、高危型阳性合并低危型阳性。
-
在本研究中，HPV DNA分型检测结果显示，阳性构成比排名前五的亚型分别为HPV52（22.13%）、 HPV16（14.32%）、HPV53（13.22%）、HPV58（10.63%）、 HPV51（9.12%）。尽管在世界范围内，高危型HPV基因型排序是HPV16、HPV18、HPV31、HPV58、 HPV52，但多项研究数据显示，亚洲地区HPV58、 HPV52的阳性率超过HPV18[4-5]。然而，对宫颈癌患者的研究显示，HPV16和HPV18依然是最常见的感染亚型[6]。相较于HPV16、HPV18，其他高危型HPV的致癌风险相对较低。女性一生中感染HPV的概率高达80%，其中90%的感染是一过性的，2~3年可被自身免疫清除。这就导致HPV DNA基因分型检测在实际应用中假阳性率偏高，由此可能导致不必要的阴道镜检查，加重患者的心理压力和经济负担。因此，寻找敏感度较好且更特异的HPV检测方法是目前研究的热点。
-
*：包括除HPV16、HPV18/45外其他高危型阳性、单纯低危型阳性和阴性。
-
Aptima HPV E6/E7mRNA检测作为一种宫颈癌前病变早期筛查的新技术，能有效评估宫颈上皮细胞因E6/E7癌基因表达导致的病变程度[7]。高危型HPV持续感染基底层细胞后，病毒E6/E7癌基因的表达水平会受细胞分化程度和患者免疫水平的影响。HPV E6/E7mRNA的表达是宫颈癌发生发展的重要因素[8]。E6/E7mRNA检测相比DNA检测，前者能更加精准地发现具有临床重要性的感染[9]。本研究中妇女宫颈高危型HPV E6/E7mRNA阳性者所占比例为12.59%（2 840/22 562），低于HPV DNA基因分型检测的高危型阳性率25.53%（7 425/29 081）。
-
为了更客观地比较两种检测方法阳性率的差异，本研究对这两种检测方法都包含的3种型别 （HPV16、HPV18/45）阳性率分年龄段比较。卡方检验结果显示，除55~＜65岁年龄段、≥65岁年龄段，其余年龄段两种检测方法中HPV16、HPV18/45阳性率的差异均有统计学意义（P ＜0.05）。这可能是因为HPV DNA分型检测是对宿主细胞内游离状态与整合状态的HPV DNA进行检测，特异性相对较低。而HPV E6/E7mRNA仅检测整合状态的病毒RNA片段，大大减少“假阳性”出现的概率。但在55~＜65岁、≥65岁两个年龄段，这两种检测方法中HPV16、HPV18/45阳性率差异无统计学意义，这可能与机体清除率下降、持续性感染率增高有关。同时提示，在这两个年龄段，两种方法的筛查效率相近。
-
本研究按照年龄对样本进行分段，不同年龄段之间，两种检测方法中高危型阳性率的分布差异均有统计学意义（P ＜0.05），说明按这种年龄段分组的研究方法有一定的临床意义。
-
在接受HPV DNA基因分型检测的标本中，高危型阳性率最高峰出现在＜25岁年龄段（50.30%），与浙江、上海的报道相似[10-11]。这可能与本研究中25岁以下年龄段就诊的女性性生活开始早、性伴侣多有关。而HPV E6/E7mRNA检测中 ＜25年龄段HPV16、HPV18/45阳性率明显低于HPV DNA分型检测。这提示该年龄段女性机体有着良好的病毒清除能力，大部分病例仅为一过性感染。因此，对于＜25岁年轻女性，不推荐进行HPV筛查。同时，在经济条件允许的情况下，可考虑尽早接种HPV疫苗。
-
在接受高危型HPV E6/E7mRNA检测的标本中，高危型阳性率排名前二的分别是≥65岁年龄段、 55~＜65岁年龄段。这虽然与HPV DNA分型检测的年龄分布模式不尽相同有关，但两种检测方法的结果提示这两个年龄段妇女HPV感染率高、E6/E7阳性率高。这可能与这两个年龄段妇女体内激素水平低、波动大，易引起免疫功能失调导致病毒的再活动有关[12]。该年龄人群普遍已绝经，宫颈上皮萎缩后以中层及外底层细胞为主，细胞学检查的假阳性率比较高。因此单独进行HPV筛查在这两个年龄段有着重要的临床意义。
-
此外，值得一提的是，各年龄段间两两比较，两种检测方法中，55~＜65岁年龄段与≥65岁年龄段间高危型阳性率差异均无统计学意义（P ＞0.05）。这就提示我们，在后续的研究中可以将这两个年龄段合并研究。
-
HPV E6/E7蛋白的表达是HPV病毒活跃的信号。与HPV DNA基因分型检测相比，E6/E7mRNA检测能有效剔除HPV一过性感染造成的假阳性结果，提高筛查效率，减少过度诊断和治疗。但是，目前HPV E6/E7mRNA检测阳性只是一个定性结果，国内外对其定量检测的最佳诊断临界点尚存在一定争议[13]，其与宫颈病变严重程度的相关性也仍需深入探讨。本次研究只对两种筛查方法进行了简单对比，二者的临床应用价值的比较还有待进一步加强。
-
参考文献
-
[1] VERHOEF V M，BOSGRAAF R P，KEMENADE F J，et al.Triage by methylation⁃maker testing versus cytology in women who test HPV ⁃ positive on self ⁃ collected cervico⁃ vaginal specimens（PROHTECT ⁃ 3）：a randomised con⁃ trolled non ⁃ inferiority trial［J］.Lancet Oncol，2014，15（3）：315-322
-
[2] LIU Q，LIN X，LIN L，et al.A comparative study of three different nucleic acid amplification techniques combined with microchip electrophoresis for HPV16 E6/E7 mRNA detection［J］.Analyst，2015，140（19）：6736-6741
-
[3] 左欣，李伟玲，朱红娣，等.高危型HPV分型在宫颈细胞学阴性者中宫颈病变的诊断价值［J］.南京医科大学学报（自然科学版），2016，36（12）：1528-1530
-
[4] LI L K，DAI M，CLIFFORD G M，et al.Human papilloma⁃ virus infection in Shenyang City，People’s Republic of China：a population ⁃based study［J］.Br J Cancer，2006，95（11）：1593-1597
-
[5] WU R F，DAI M，QIAO Y L，et al.Human papillomavirus infection in women in Shenzhen City，People’s Republic of China，a population typical of recent Chinese urbanisa⁃ tion［J］.Int J Cancer，2007，121（6）：1306-1311
-
[6] MALISIC E，BROTTO K，KRIVOKUCA A，et al.Overall human papillomavirus and types 16/18 prevalence in women with normal cervical cytology in Serbia：is it time for human papillomavirus testing and/or vaccination?［J］.J BUON，2014，19（4）：937-939
-
[7] DURZYNSKA J，LESNIEWICZ K，POREBA E.Human papillomaviruses in epigenetic regulations［J］.Mutat Res Rev Mutat Res，2017，772（1）：36-50
-
[8] REN C C，ZHU Y H，YANG L，et al.Diagnostic perfor⁃ mance of HPV E6/E7 mRNA assay for detection of cervi⁃ cal high⁃grade intraepithelial neoplasia and cancer among women with ASCUS Papanicolaou smears［J］.Arch Gyne⁃ col Obstet，2018，297（2）：425-432
-
[9] 张丽娜，周蓓蓓，来艺青，等.高危型 HPVE6/E7mRNA 检测在HPV DNA 阳性患者中的临床意义［J］.南京医科大学学报（自然科学版），2018，38（10）：1401-1403
-
[10] 夏艳，金志军，倪云翔，等.上海市人乳头瘤病毒感染及病毒分型与宫颈病变的探讨［J］.第二军医大学学报，2017，38（12）：1526-1531
-
[11] YE J，CHENG X，CHEN X，et al.Prevalence and risk pro⁃ file of cervical human papillomavirus infection in Zheji⁃ ang Province，southeast China：a population ⁃ based study ［J］.Virol J，2010，7（66）：66
-
[12] ALTHOFF K N，PAUL P，BURKE A E，et al.Correlates of cervico vaginal human papillomavirus detectionin peri⁃ menopausal women［J］.J Womens Health（Larchmt），2009，18（9）：1341-1346
-
[13] 顾青，赵艳.子宫颈HPV E6，E7mRNA检测的临床诊断及预后评估价值研究进展［J］.诊断学理论与实践，2019，18（2）：228-231
-
摘要
目的：探讨人乳头瘤病毒（human papillomavirus，HPV）DNA基因分型和E6/E7 mRNA检测技术在宫颈癌早期筛查中的临床价值。方法：用PCR⁃反向点杂交方法对29081名妇女进行宫颈脱落细胞HPV DNA 基因分型检测，对高危型阳性率、亚型分布统计分析；用Aptima mRNA逆转录扩增法对22562名妇女进行宫颈脱落细胞HPV E6/E7 mRNA检测，对高危型感染率统计分析；比较不同检测方法和不同年龄段高危型感染率的差异。结果：在接受HPV DNA基因分型检测的29081例标本中， HPV阳性率为29.57%（8602/29081）；高危型HPV感染前5名依次为HPV52、HPV16、HPV53、HPV58、HPV51；高危型阳性率最高峰出现在＜25岁年龄段。在接受HPV E6/E7 mRNA检测的22562例标本中，高危型阳性率为12.59%（2840/22562），高危型阳性率排名前二的分别是≥65岁年龄段、55~64岁年龄段。除55~64岁年龄段、≥65岁年龄段外，其余年龄段两种检测方法之间HPV16、HPV18/45阳性率差异均有统计学意义（P＜0.05）。结论：HPV E6/E7 mRNA检测可有效减少“假阳性”结果，提高筛查效率。应重视≥55岁女性的HPV筛查，在该年龄段的女性中，两种HPV检测方法的筛查效率相近。
关键词
人乳头瘤病毒 ； HPV DNA ； E6/E7 mRNA ； 宫颈癌