甲基苯丙胺（methamphetamine，Meth），俗称冰毒，其滥用已成为世界性公共卫生问题，Meth滥用表现为肝脏、肾脏、免疫、精神、神经多组织多系统损伤，甚至导致死亡^[1]。研究显示，神经系统是Meth作用的主要靶器官，因其损伤导致的学习记忆能力下降、海马区体积缩小、多巴胺能神经元特异性凋亡等神经退行性病变虽近年来引起人们的广泛关注^[2]，但其毒性作用及机制仍有待明确。神经炎性反应被认为是Meth滥用引起神经元损伤的主要机制之一，涉及脑中小胶质细胞的激活伴随大量炎性因子的释放。利用体外实验，我们前期研究发现， Meth暴露可引起Toll样受体（Toll like receptors， TLR）⁃4的高表达，伴随下游炎性通路丝裂原活化蛋白激酶（mitogen ⁃activated protein kinase，MAPK）及核因子（nuclear factor，NF）⁃κB的激活^[3]，然而Toll样受体家族包含多个亚型受体，Meth暴露是否可引起其他亚型TLR表达改变，TLR与下游信号通路如何进行信号传递？这些问题仍不清楚。因此，本研究通过Meth暴露后对TLR的表达，下游接头蛋白髓样分化因子（myeloid differentiation factor 88，MyD88）、 β干扰素TIR结构域衔接蛋白（TIR⁃domain⁃contain⁃ ing adaptor inducing interferon⁃β，TRIF）及泛素化蛋白E3泛素连接酶Pellino 1（Peli1）的探讨，旨在阐述TLR⁃Peli1轴在Meth引起小胶质细胞炎性反应中的作用，从而为Meth神经毒性的干预提供潜在靶点。

1 材料和方法

1.1 材料

BV2细胞系来自ATCC（美国），Meth（北京中国食品药品检定研究所，标准品号：171212，纯度99.9%），DMEM（Hyclone公司，美国），胎牛血清 （Gibco公司，美国），BCA蛋白定量试剂盒（Thermo Scientific公司，美国），Anti⁃TLR3、Anti⁃TLR4、Anti⁃ TLR8、Anti ⁃TLR11、Anti ⁃TRIF、Anti ⁃MyD88（Abcam公司，美国），Anti⁃TLR7（Santa Cruz公司，美国），Anti ⁃NF⁃κB p65、Anti⁃Phospho NF⁃κB p65（Cell Signaling Technology公司，美国），Anti ⁃ Peli1（Santa Cruz，美国），Anti⁃β⁃actin（Sigma Aldich公司，美国），HRP标记的二抗：HRP Goat Anti ⁃Rabbit IgG（H+L）、HRP Goat Anti⁃Mouse IgG（H+L）、HRP Goat Anti⁃Rat IgG （H+L）（Jacksonimmuno公司，美国），PVDF膜及ECL发光液（Millipore公司，美国），Lipofectamin 2000转染试剂（Thermo Fisher Scientific公司，美国），Peli1siRNA、TLR siRNA及对照组siRNA（上海吉玛公司），TNF⁃α及IL⁃6ELISA试剂盒（R&D公司，美国）。

1.2 方法

1.2.1 细胞培养

将BV2（小鼠小胶质细胞）培养于DMEM（含10%胎牛血清、1%青霉素和链霉素）培养液，置于细胞培养箱（37℃、5%CO₂）培养2~4d，隔天更换培养液。该细胞经Meth处理后，进行后续实验。

1.2.2 蛋白免疫印迹分析

将细胞PBS清洗后，用含Cocktail的蛋白裂解液 （RIPA，1∶500）裂解，离心后取上清，利用BCA蛋白试剂盒进行定量。每孔泳道加入30 μg蛋白进行电泳，将蛋白转至PVDF膜，利用5%脱脂奶粉溶液进行封闭，并与一抗进行预孵过夜。次日，与二抗孵育1h，将ECL发光液A液、B液（1∶1）均匀覆于膜上，置于Bio⁃Rad凝胶成像系统成像。Western blot条带经Image J软件进行灰度扫描分析。

1.2.3 ELISA检测炎性因子

在孔板上设标准品孔8孔，在第1孔加标准品200 μL，然后从第1孔取100 μL加到第2孔（第2~8孔都含有标准品稀释液），混匀后，再从第2孔取出100 μL加入第3孔，依次进行梯度稀释，最后一孔仅为稀释液不再添加标准品。稀释后各孔加样量都为100 μL，浓度分别为1 000.0、500.0、250.0、125.0、 62.5、31.3、15.7、0ng/mL。Meth与BV2细胞孵育24h后，取其上清10 μL，加入到预先加有90 μL稀释液的孔中（即每孔100 μL），孵育2h，洗涤，每孔加入酶标抗体工作液1h，洗涤后，加入底物工作液100 μL，反应20min后加入50 μL终止液，混匀，在492nm波长下测定其吸光度值。该实验分别重复3次（即细胞与Meth染毒3次），每次每个样本设3个平行复孔，数据以均数±标准差（$\stackrel{-}{x}$ ± s）形式表示。

1.2.4 实时定量PCR

提取BV2细胞mRNA后，通过PrimeScript^TM RT reagent Kit反转录试剂（TaKaRa公司，日本），取0.5 μg mRNA将其逆转录成cDNA，按PrimeScript^TM reagent Kit试剂盒说明书进行扩增，重复3次，每次平行复孔5个，β⁃actin作为内参，通过2^-ΔΔCt法对结果进行定量。

1.2.5 BV2细胞siRNA干扰

为研究Peli1、TLR4在Meth引起炎性因子释放中的作用，将BV2细胞分为对照组（不做任何处理）、NC组（加入对照siRNA）、Meth组（加入Meth处理），NC+Meth组（加入对照siRNA和Meth处理）， SiPeli1组（加入Peli1siRNA处理），SiTLR4+Meth组 （加入TLR4siRNA和Meth处理），SiPeli1+Meth组 （加入Peli1siRNA和Meth处理）。siRNA由上海吉玛制药技术有限公司设计，将5×10⁵ 个细胞接种于6孔板（不含抗生素）中，利用Lipofectamine2000进行转染，用200 μL Opti⁃MEM I Reduced Serum Medium （Thermo Fisher Scientific公司，美国）稀释，加入Peli1siRNA，室温静置20min，形成siRNA⁃转染试剂混和物，将siRNA⁃转染试剂混和液加入含有细胞及培养液的孔中，均匀混和。在37℃的CO₂培养箱中培养，6h后可将培养基换为含血清的完全培养基； 24h后在蛋白水平观察Peli1干扰后的表达水平。

1.3 统计学方法

使用SPSS20.0软件进行统计学分析，多组定量资料比较采用单因素方差分析（one⁃way ANOVA）检验，多组间数据两两比较用Dunnett⁃t 检验，两组定量数据比较用Student’s t test，P< 0.05为差异有统计学意义，绘图使用GraphPad Prism 7.0。

2 结果

2.1 Meth对小胶质细胞IL⁃6、TNF⁃α表达的影响

基于我们前期工作中Meth的使用浓度结合Meth滥用后在人体液中浓度的报道^[4-5]，300 μmol/L Meth用来处理小胶质细胞24h。Meth作用后，利用ELISA检测细胞上清液炎性因子的浓度，结果显示， Meth处理的BV2细胞分泌的IL⁃6、TNF⁃α的含量与对照组比较显著上升，差异有统计学意义（P< 0.001，图1A、1B）。

2.2 Meth对多种亚型TLR蛋白的作用

TLR在引发小胶质细胞IL⁃6及TNF⁃α表达及分泌过程中发挥重要作用。因此，我们在蛋白水平观察了Meth对小胶质细胞TLR家族中4、7、8亚型受体蛋白的表达（图2A~D）。将BV2细胞分别与0、 100、300、900 μmol/L Meth孵育24h，发现TLR7、 TLR8蛋白表达量随Meth浓度的增加而升高，差异有统计学意义（P< 0.05）。接着，利用300 μmol/L Meth与BV2细胞分别孵育0、6、12、24、48h（图2E~G），发现TLR7、TLR8在Meth作用24h时表达最高。

上述受体皆可通过MyD88这一接头蛋白传递炎性信号，而TLR3是唯一通过TRIF这一接头蛋白传递下游信号的^[6]，因此，本研究亦观察了Meth对TLR3表达的改变，不同浓度Meth（0、100、300、900 μmol/L）与BV2细胞孵育24h后，TLR3表达呈浓度依赖性增高 （图3A、B），而将Meth与BV2细胞孵育不同时间（0、 6、12、24、48h）后，发现TLR3在12h及24h时间点上调，后逐渐恢复（图3C、D）；此外，本研究亦观察了TLR11在Meth作用后的改变。Meth作用BV2细胞后，TLR11的表达显著上升（图3E、F），与BV2细胞分别孵育不同时间点后（图3G、H），与对照组相比，各时间点的TLR11表达显著增高（P< 0.05）。

2.3 Meth对接头蛋白MyD88及TRIF通路表达的影响

接着对TLR介导的下游MyD88依赖型和MyD88非依赖型TRIF信号通路进行了探讨。不同浓度Meth处理BV2细胞24h后，TRIF蛋白表达增高，与对照组比较，差异有统计学意义（P< 0.05，图4A、C）；此外，300 μmol/L Meth与BV2细胞孵育不同时间，TRIF在各时间点均表达增高，其中24h时间点TRIF的表达达到峰值（图4B、D）。此外，MyD88在Meth暴露后，亦有明显增加的趋势，且差异有统计学意义（图A、B、E、F，P< 0.05）。

2.4 Meth对小胶质细胞Peli1蛋白表达的影响

Peli1蛋白在TLR4介导的小胶质细胞炎症反应中起“桥梁”作用，因而本研究探讨了Meth对小胶质细胞中Peli1蛋白表达的影响。300 μmol/L Meth处理BV2细胞0、15min、30min、1h、3h、6h、12h和24h，Peli1蛋白表达随时间逐渐升高，3h达到峰值后有下降趋势，但均高于未处理组（P< 0.05，图5）。

2.5 Peli1 对Meth引起小胶质细胞炎性因子表达、释放及NF⁃κB通路的影响

TLR4是唯一可以同时介导MyD88及TRIF通路的TLR^[7]，因此，本研究观察了TLR4及Peli1在Meth引起炎性反应中的作用。Peli1经siRNA干扰后，蛋白表达量明显降低（图6A）；Meth暴露促进TNF⁃α及IL ⁃6的表达，而Peli1干扰后，TNF⁃α及IL⁃6分泌降低 （图6B~D）。此外，在mRNA水平，Peli1的敲减同样缓解了Meth引起炎性因子iNOS及TNF⁃α mRNA表达的增多（图6E、F）。

基于上述Peli1下调可明显逆转Meth促进炎性递质产生的现象，观察了炎性调节的关键通路NF⁃ κB的激活情况。Peli1干扰24h后，Meth作用BV2细胞30min，NF⁃κB被显著激活，而将Peli1下调后， Meth引起NF⁃κB的激活情况被明显逆转，差异有统计学意义（图7）。

3 讨论

目前，以苯丙胺类、氯胺酮为代表的新型合成类毒品滥用增长迅速，且向低龄化趋势发展。现有数据表明，在多种苯丙胺毒品中，Meth造成的全球健康威胁最大。该威胁不仅在于其全球的快速蔓延，更重要的是，Meth滥用引起机体极大的损伤，尤其是中枢神经系统，研究显示，Meth滥用可引起神经退行性病理性蛋白的聚集，继而损伤神经细胞^[8]。因此，Meth的滥用已成为全球范围内日益严峻的公共卫生问题。

Meth损伤神经元的机制比较复杂，主要涉及氧化应激损伤、兴奋性毒性、恶性高热及炎症反应等^[9]，而这些机制的探讨多建立在Meth对神经元的直接损伤上，对数量10倍于神经元的胶质细胞的作用研究较少。越来越多的证据显示，神经元及胶质细胞所处的微环境改变对神经元生理、病理的变化发挥重要作用，尤其是小胶质细胞介导的炎性微环境。

TLR是Ⅰ型跨膜蛋白，其胞外结构参与多种病原体的识别，胞内含有Toll/IL⁃1受体同源区，参与信号转导。研究显示，小胶质细胞表达多种Toll样受体蛋白^[10]，在调节神经炎性微环境、引起神经元损伤的过程中发挥重要作用。TLR介导的信号传递主要分为MyD88依赖性和MyD88非依赖性两种，前者通过激活肿瘤坏死因子受体活化因子6（TNF recep⁃ tor associated factor 6，TRAF6）支配MAPK和NF⁃κB信号转导途径，产生炎性因子^[11]。而后者通过接头蛋白TRIF激活下游信号IRF3的转录及NF⁃κB磷酸化，诱导炎性反应^[12]。目前关于Meth对TLR的调节多集中于TLR4，研究显示，Meth可通过结合并稳定MD⁃2受体与TLR4的结合，引起小胶质细胞的激活及IL⁃6大量分泌，引起中枢伏隔核多巴胺释放增多，导致神经毒性^[3]。既往研究显示，Meth可通过上调TLR4的表达，引起下游炎性通路激活及炎性因子TNF⁃α、IL⁃1β、IL⁃6的释放^[13]。此外，最近研究显示，Meth同样可通过其他TLR介导炎症反应。 Burns等^[14] 将Meth与巨噬细胞孵育，发现炎性因子TNF⁃α、IL⁃8、CXCL1、CXCL16显著升高，而这一过程依赖于TLR9。本研究首次发现，Meth作用后，除了TLR4及TLR9，TLR3、TLR7、TLR8及TLR11蛋白水平表达亦显著增高，提示这4种TLR的亚型可能在Meth引起小胶质细胞的炎性反应或其他功能中发挥潜在作用，但其作用及机制仍需进一步深入挖掘。因TLR3通过TRIF途经调节下游信号，TLR4可同时调节MyD88及TRIF介导的下游信号，而其他TLR仅通过MyD88完成下游信号的传递，因此，对TLR下游信号进行进一步探索，发现Meth作用后，接头蛋白MyD88表达上调，同时另一接头蛋白TRIF表达亦明显增加，进一步证明了上述多种TLR参与Meth引起炎性反应的可能性。此外，本研究还证明了Peli1在Meth引起下游炎性信号传递中的作用。 Peli家族有Peli1、Peli2、Peli3，近年来，Peli1介导的炎性作用在多种炎性模型中被揭示。有学者利用脂多糖建立小胶质细胞炎症模型，发现Peli家族中仅有Peli1上调，提示Peli1在小胶质细胞炎性反应中的特异性。Chang等^[15] 通过建立小鼠脓毒血症休克模型，发现高剂量脂多糖在9h内引起大多数小鼠死亡，而Peli1敲除的脓毒性休克小鼠24h后亦未发生死亡现象。本研究将Peli1敲减后，Meth引起的TNF⁃α、IL⁃6等炎性因子分泌及表达显著降低，而调节炎性信号的NF⁃κB活性被显著抑制，说明Peli1在Meth引起的小胶质细胞炎性反应中发挥重要作用。

综上所述，Meth暴露可引起多种TLR的表达， 引起大量炎性因子的表达及分泌，在该过程中， MyD88、TRIF及其下游泛素化蛋白Peli1发挥重要作用（图8）。因此，针对TLR⁃MyD88/TRIF⁃Peli1将有利于Meth神经毒性的干预。

参考文献