人类血小板抗原（human platelet antigen，HPA）位于血小板膜糖蛋白上，由GenBank数据库中ITGA2B、 ITGB3、GP1BA、ITGA2、GP1BB和CD109相关序列进行编码。在临床血小板输注过程中，输注HPA不匹配的血小板，可导致受血者机体产生血小板同种抗体，引起同种免疫血小板减少综合征、输血后紫癜、血小板输注无效等输血不良反应^[1-4]。尽管血清学交叉配合试验可以降低输血不良反应的发生率，但无法预防需长期输注血小板患者同种抗体的产生，因此通过对献血者和患者进行血小板基因分型，为患者提供HPA基因型相匹配的血小板，可以有效避免血小板特异性免疫反应的发生，提高输血的疗效和安全性，因此建立基于基因配型的血小板捐献者血型资料库是解决需长期输注血小板患者同种免疫反应的有效途径，在临床输血应用中具有重要意义。本研究的目的就是建立国内首个基于MassARRAY平台的人HPA1~29W系统基因分型的质谱检测方法，为血小板的建库工作提供高效和高性价比的HPA基因分型方法。

1 材料和方法

1.1 材料

12 个插入HPA1⁃29W野生型和突变型序列的合成质粒以及50例经PCR⁃SSP检测的已知HPA分型的献血者样本。本研究经江苏省血液中心伦理委员会批准，所有受试者知情同意。

采用全自动核酸提取仪（E.HT01.Z0.0096）及配套的全血DNA提取试剂盒（K.QX02.B0.1000）（南京中科拜尔公司），384孔板PCR扩增仪（Ge⁃ nAmp9700，ABI公司，美国），SDx MassARRAY MAL⁃ DI⁃TOF质谱检测系统、Complete iPLEX Pro Genotyp⁃ ing Reagent Set（Agena公司，美国），RNase⁃free Water （货号为RT121⁃02，北京天根公司）等。

1.2 方法

1.2.1 HPA1⁃29W野生型和突变型序列参考质粒的构建

针对HPA1⁃29W野生型（A型）和突变型（B型）所有靶点单核苷酸多态性（single nucleotide polymor⁃ phism，SNP）或突变位点[5 （] 表1）及其两端100个左右碱基序列设计插入片段序列，合成后克隆至pUC57载体，转化E.coli DH5，提取质粒、酶切鉴定并测序。

1.2.2 基于MassARRAY平台的人HPA1⁃29W系统基因分型的质谱检测方法的建立

以包含HPA ⁃1a~29a和HPA ⁃1b~29bw序列的HPA基因分型参考质粒建立人HPA1⁃29W系统基因分型的质谱检测方法，并以50例已知HPA分型的献血者样本对该方法进行验证和确认。

基因组DNA制备：采用磁珠法提取试剂盒在全自动核酸提取仪上进行基因组DNA提取，DNA终浓度为10~200ng/μL。

多重PCR扩增：使用美国Sequenom公司Geno⁃ typing Tools MassARRAY Assay Design软件^[6] 针对所有靶点SNP或突变（表1），设计PCR扩增引物及单碱基延伸引物（由上海生工公司合成，表2）。将待测的所有样品信息进行排版，每份样品做2个复孔，使用多重PCR技术在384孔板上扩增含有目的SNP的DNA序列，PCR扩增体系为5 μL，包括2 μL待测DNA样本（浓度20~50ng/μL）和3 μL反应体系（含1 μL 0.5 μmol/L PCR引物工作液，0.8 μL RNase ⁃ free Water，0.5 μL 10×Buffer，0.4 μL 25mmol/L MgCl2， 0.1 μL 25mmol/L dNTP，0.2 μL 5U/μL Hotstar⁃ Taq）。PCR扩增条件为：95℃ 2min；95℃ 30s、 56℃ 30s、72℃ 1min，45个循环；72℃ 5min；12℃ 保持。

碱性磷酸酶处理：扩增成功的PCR产物每孔取5 μL加入核酸外切酶Ⅰ2.5U，碱性磷酸酶0.5U进行纯化，去除未结合的dNTP，纯化反应的条件为： 37℃ 40min；85℃ 5min；12℃保持。

iPLEX单碱基延伸：针对每个靶点SNP设计1条延伸引物，将混合好的延伸引物加入上述纯化后的产物中，以ddNTP为底物，进行单碱基延伸，每个SNP的等位基因延伸产物仅有末端1个碱基的差异，单碱基延伸程序如下：94℃ 30s；94℃ 5s， （52℃ 5s、80℃ 5s，5个循环），40个循环；72℃ 3min；12℃保持。

核酸质谱检测：利用Nano树脂板（规格为6mg） 纯化单碱基延伸的产物，并将产物转移到Spectro⁃ CHIP芯片上，进行质谱检测，将样品结果进行聚类，根据聚类图进行结果判读，判读完成后导出Plate⁃ Data数据。同1个SNP的等位基因由于碱基不同导致分子量不同，形成不同的检测峰而被区分。

灵敏度分析：利用检测质粒样品，29个等位基因共58个位点，每种分型检测1次，计算灵敏度。灵敏度=真阳性结果/（真阳性结果+假阴性结果）× 100%。真阳性结果是质粒结果为非A型、质谱结果也为非A型的数量。假阴性结果是质粒结果为非A型、质谱结果为A型的数量。灵敏度100%为达标。

特异度分析：检测质粒样品，58个位点每种分型检测1次，计算特异度。特异度=真阴性结果/（真阴性结果+假阳性结果）×100%。真阴性结果为质粒结果为A型、质谱结果也为A型的数量。假阳性结果为质粒结果为A型、质谱结果为非A型的数量。特异度100%为达标。

重复性分析：检测质粒样品，58个位点每种分型均重复检测10次，检测一致性，同时计算1次检测成功率。一致性100%、1次检测成功率大于98%为达标。

1.2.3 已知HPA分型样本的检测

利用MassARRAY平台检测50例已知HPA分型的献血者样本，每个样品重复检测1次，分析1次检测成功率和重复检测一致性，并利用一代测序技术，抽检其中15例标本的部分检测位点，检验质谱分析技术对献血者样本分型的灵敏度和特异度。

1.3 统计学方法

采用SPSS 15.0统计学软件对实验数据进行统计学处理。献血者抽检标本的一代测序检测结果与质谱检测结果的比较采用四格表配对卡方检验， P< 0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 HPA1⁃29W野生型/突变型序列参考质粒的构建

共合成12个插入HPA1⁃29W野生型/突变型序列的参考质粒（生工生物工程股份有限公司，工作编号DA2938⁃DA2949），插入片段大小为683~1 005bp，合成质粒序列及测序结果如下（以DA2938质粒为例）。

克隆至pUC57质粒中野生型HPA⁃ 1、HPA⁃10、 HPA⁃2、HPA⁃5和HPA ⁃6的插入序列（下划线部分为SNP）：5′⁃TTAGCTATTGGGAAGTGGTAGGGCCTGCAGGAGGTAGAGAGTCGCCATAGCTCTGATTGCTGGACTTCTCTTTGGGCTCCTGTCTTACAGGCCCTGCCTC$\underset{\_}{\mathrm{T}}$GGGCTCACCTCGCTGTGACCTGAAGGAGAATCTGCTGAAGGATAACTGTGCCCCAGAATCCATCGAGTTCCCAGTGAGTGAGGCCC$\underset{\_}{\mathrm{G}}$AGTACTAGAGGACAGGCCCCTCAGCGACAAGGGCTCTGGAGACAGCTCCCAGGTCACTCAAGTCAGTCCCCAGAGGATTGCACTCCGGCTCCGGCCAGGTCTGACCTCGCTGCCTCTTGGTGCCCTGCGTGGTCTTGGCGAACTCCAAGAGCTCTACCTGAAAGGCAATGAGCTGAAGACCCTGCCCCCAGGGCTCCTGA$\underset{\_}{\mathrm{C}}$GCCCACACCCAAGCTGGAGAAGCTCAGTCTGGCTAACAACAACTTGACTGAGCTCCCCGCTGGGCTCCTGAATGGGCTGGAGAATCTCGACACCCTTCTCGGATAAAGACACCATTACAGACGTGCTCTTGGTAGGTGCACCAATGTACATGAGTGACCTAAAGAAAGAGGAAGGAAGAGTCTACCTGTTTACTATCAAA$\underset{\_}{\mathrm{G}}$AGGTAAAAAAAAAAAAATAAACTAATAGTTTAATTTGCTTTAGTACTGGTAATTTAACTTGCATTTGGAAAGAAAAATTTATTATTATTGAATGATAATTGAGTGTGGGGTATGCCGTTGTGGGCCTGGCTGGCTGGGATCCCAGTGTGAGTGCTCAGAGGAGGACTATCGCCCTTCCCAGCAGGACGAATGCAGCCCCC$\underset{\_}{\mathrm{G}}$GGAGGGTCAGCCCGTCTGCAGCCAGCGGGGCGAGTGCCTCTGTGGTCAATGTGTCTGCCACAGCAGTGACTTTGGCAAGATCACGGGCAAGTACTGC ⁃ GAG⁃3′。

DA2938质粒中野生型HPA⁃1、HPA⁃10、HPA⁃2、 HPA⁃5和⁃ HPA⁃6插入序列的测序图经酶切鉴定， DA2938质粒测序分析结果与GenBank数据库中公布的序列完全一致（图1），为野生型HPA⁃1、HPA⁃ 10、HPA⁃2、HPA⁃5和HPA⁃6。

2.2 MassARRAY MALDI⁃TOF质谱检测和一代测序HPA分型

以HPA⁃15为例，MassARRAY MALDI⁃TOF质谱检测和一代测序HPA分型见图2。DA2943质粒含野生型HPA⁃15、HPA⁃17、HPA⁃18、HPA⁃20、HPA⁃22的SNP位点及两端相关序列，质谱和一代测序的检测结果均为HPA⁃15a型。

2.3 参考质粒的质谱分析

质粒样品的灵敏度检测：29个位点每种分型检测1次，共计87个分型结果。其中A型结果定义为阴性，共29个，非A型（A型和AB型）结果定义为阳性，其中B型29个、AB型29个，共58个。实际检测真阳性结果58个，假阴性结果0个，灵敏度=58/58× 100%=100%。

质粒样品的特异度检测：29个位点每种分型检测1次，共计87个分型结果。其中A型结果（29个） 定义为阴性，非A型（B型29个和AB型29个）结果定义为阳性。实际检测真阴性结果29个，假阳性结果0个，特异度=29/29×100%=100%。

质粒样品的重复性检测：29个位点每种分型均重复检测10次，共计870个分型结果，其中A型结果290个，B型结果290个，AB型结果290个，检测一致性为100%，1次检测成功率为100%。

2.4 已知HPA分型样本的质谱分析

预期获得1 450个数据，实际检测中有1个数据未检出。1次检测成功率=1 449/1 450 × 100%=99.93%。

50例样品重复检测一致性：除未检出的1例结果，其他所有结果2次重复均一致，一致性=1 448/1 450×100%=99.86%。

15例抽样样品的部分抽检位点一代测序与质谱检测结果：共随机抽取15例样品和127个位点进行一代测序和质谱分析，共有真阳性结果（质谱结果为非A型、测序结果也为非A型）21例，假阳性结果（质谱结果为A型、测序结果为非A型）0例，假阴性结果（质谱结果为非A型、测序结果为A型）0例，真阴性结果（质谱结果为A型、测序结果也为A型） 106例，灵敏度=真阳性/（真阳性+假阴性）×100%=21/（21+0）×100%=100%，特异度=真阴性/（真阴性+ 假阳性）×100%=106/（106+0）×100%=100%，2种方法检测结果的一致性为100%（表3）。

3 讨论

人血小板上存在多种抗原，引起患者发生同种免疫的抗原主要是ABO血型抗原、HLA⁃Ⅰ类抗原、CD36和HPA。在卫生行政部门颁布的《临床输血技术规范》以及卫生行业标准WS/T623⁃2018《全血和成分血使用》中，只规定血小板输注需按照ABO同型或相合原则输注，致使多次随机输注血小板的患者容易产生相应的HLA、CD36和HPA抗体，造成免疫性血小板输注无效。仅就HPA系统而言，国际血小板命名委员会近年来已正式命名了35个用血清学检出的血小板抗原，并将35个HPA分为29个系统（或准系统），其中HPA⁃1、HPA⁃2、HPA⁃3、HPA⁃ 4、HPA⁃5、HPA⁃15组成双等位基因的抗原系统，其他抗原均未检出对偶抗原^[5，7-8]。从理论上说，每个HPA系统的抗原都可以引发特异性HPA抗体介导的免疫性血小板输注无效，因此血小板捐献者血型资料库范围最好涵盖上述29个HPA系统。国内迄今尚未对血小板捐献者HPA基因型资料库的建库工作形成统一标准，各地根据当地实际情况和从卫生经济学的角度出发，在建库过程中有选择性地对捐献者的HPA系统进行基因分型，主要有检测HPA1~6、HPA⁃15、HPA⁃21w模式，HPA⁃1~17w模式、 HPA⁃1~21w模式或者其他模式^[9]。国内对HPA1⁃ 28bw的研究已有报告^[1]，但HPA⁃29w在中国人群中的分布尚未见报道，出于研究中国人群HPA1⁃29bw多态性分布以及满足患者长期临床治疗效果考虑，我们在建库中采用HPA1~29bw的分型模式。

χ²=0.000，P=1.00。

HPA数据库的建库规模很大程度上取决于HPA系统中bb纯合子的基因频率。报道在浙江汉族人群中获取1个HPA⁃1系统的bb纯合子，理论上需要筛查20 408名供者^[9]，而浙江汉族人群HPA⁃1b等位基因频率（0.007 5）^[1] 远高于HPA⁃4b等位基因频率（0.003 0），获取HPA⁃4bb纯合子需要筛查更多供者。另外，国人在EMBL数据库中有极低频率的HPA⁃10bw（0.000 5）^[10]，还在江苏汉族人群中发现1例国内尚未见报道的HPA⁃11bw，其等位基因频率比HPA⁃10bw更低（结果尚未公开报道），这些低频HPA对建库库容提出了更高标准，如果考虑ABO血型抗原、HLA和CD36的因素，血小板捐献者基因型资料库的库容必须具备足够大的规模才能够满足临床需求。据统计，2017年国内血小板献血者HLA和HPA基因型数据库共登记25 240人的分型资料，但当年HLA或HPA基因型配合应用总和仅137例^[11]，其原因之一就是受制于库容这一瓶颈。可以预期未来建立血小板捐献者基因型资料库的规模和投入的人力物力是相当可观的，因此建库所选择的HPA基因分型方法，最好在兼顾检测准确度和检测通量的前提下，符合卫生经济学的要求。

尽管HPA的基因频率分布在不同种族、不同区域中存在差异，但HPA多态性的分子基础已经阐明，除了HPA⁃14w的AAG三联体缺失导致的突变外，大多数抗原发生的变异主要是编码这些糖蛋白基因的SNP引起的^[5]，造成了对应蛋白质中氨基酸的改变和血小板表面的糖蛋白多态性，这为已知血小板变异的基因分型提供了基础。目前HPA基因分型检测方法主要有聚合酶链反应核苷酸特异性引物技术（PCR⁃SSP）、核苷酸序列测定法（PCR⁃SBT）、基于Luminex的聚合酶链反应序列特异性寡核苷酸探针技术（PCR⁃SSO）、实时定量荧光聚合酶链反应（real ⁃time PCR）、吸电离飞行时间质谱分析（MALDI⁃TOF⁃ MS）以及下一代测序技术（NGS）等^[1，12-13]；以上分型方法均存在检测通量低、成本高以及自动化程度低等缺陷，不利于开展大规模的建库工作。MassARRAY核酸质谱阵列基因分析系统是一个功能强大的核酸质谱定性定量平台，它完美地结合了质谱检测的高分辨率、PCR扩增的高敏感度以及生物芯片技术的高通量，无需杂交及荧光染料等二级标记物，直接以分子量为标记对样本进行多方位分析，具有位点选择灵活、检测结果可靠、检测通量高、检测成本低的优点^[14-16]。MassARRAY技术的检测成本远低于PCR⁃SBT和NGS，而检测通量远高于上述2个测序技术，且定制灵活，可以自由选择感兴趣的SNP位点进行设计，因此从技术性能和卫生经济学的角度，MassARRAY核酸质谱阵列基因分析系统是最适合血小板供者资料库构建的分型技术。

本研究采用12个插入HPA⁃1~29w野生型和突变型序列的参考品质粒建立基于MassARRAY平台的人HPA1⁃29W系统基因分型技术，50例血液基因组DNA样品质谱检测结果表明，其临床灵敏度和特异度均为100%，重复检测的一致性均为100%，1次检测成功率为99.93%，符合预期制定的定制化检测HPA位点的各项性能指标。综上所述，本研究建立了国内首个基于MassARRAY平台、人HPA1⁃29W系统基因分型的质谱检测方法，可以为血小板捐献者血型资料库构建工作提供高效和高性价比的HPA基因分型手段，不仅可以提高输血的疗效和安全性，减少血小板输注无效的发生，还能够有效降低患者的经济负担、节约宝贵的血液资源。

参考文献