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NEK7在慢性肝脏炎症及纤维化形成中的作用

  • 王艺睿

    机 构：

    南京医科大学第一附属医院肝胆中心,江苏 南京 210029

    ×
  • ，王皓

    机 构：

    南京医科大学第一附属医院肝胆中心,江苏 南京 210029

    ×
  • ，刘硕琛

    机 构：

    南京医科大学第一附属医院肝胆中心,江苏 南京 210029

    ×
  • ，倪鸣

    机 构：

    南京医科大学第一附属医院肝胆中心,江苏 南京 210029

    ×
  • ，李相成

    机 构：

    南京医科大学第一附属医院肝胆中心,江苏 南京 210029

    ×

南京医科大学第一附属医院肝胆中心,江苏 南京 210029；

NEK7 in chronic liver inflammatory and liver fibrosis

  • WANG Yirui

    Affiliation：

    Hepatobiliary Center,the First Affiliated Hospital of Nanjing Medical University,Nanjing 210029 ,China

    ×
  • ，WANG Hao

    Affiliation：

    Hepatobiliary Center,the First Affiliated Hospital of Nanjing Medical University,Nanjing 210029 ,China

    ×
  • ，LIU Shuochen

    Affiliation：

    Hepatobiliary Center,the First Affiliated Hospital of Nanjing Medical University,Nanjing 210029 ,China

    ×
  • ，NI Ming

    Affiliation：

    Hepatobiliary Center,the First Affiliated Hospital of Nanjing Medical University,Nanjing 210029 ,China

    ×
  • ，LI Xiangcheng

    Affiliation：

    Hepatobiliary Center,the First Affiliated Hospital of Nanjing Medical University,Nanjing 210029 ,China

    ×

Hepatobiliary Center,the First Affiliated Hospital of Nanjing Medical University,Nanjing 210029 ,China；

通讯作者:

李相成,E⁃mail:drxcli@njmu.edu.cn

中图分类号:R575.2

文献标识码:A

文章编号:1007-4368(2021)05-663-08

DOI:10.7655/NYDXBNS20210505

参考文献 1
XIAO J，WANG F，WONG N K，et al.Global liver disease burdens and research trends：analysis from a Chinese per⁃ spective［J］.J Hepatol，2019，71（1）：212-221
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参考文献 2
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参考文献 4
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参考文献 5
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参考文献 6
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参考文献 7
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参考文献 9
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参考文献 10
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参考文献 11
周顺，王勇，张峰，等.巨噬细胞中神经损伤诱导蛋白1在肝脏缺血再灌注损伤及其炎症反应中的作用［J］.南京医科大学学报（自然科学版），2021，41（2）：166-172
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参考文献 12
YUE S，ZHU J，ZHANG M，et al.The myeloid heat shock transcription factor 1/β⁃catenin axis regulates NLR fami⁃ ly，pyrin domain⁃containing 3 inflammasome activation in mouse liver ischemia/reperfusion injury［J］.Hepatology，2016，64（5）：1683-1698
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参考文献 13
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参考文献 14
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参考文献 15
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目录contents

    摘要

    目的：探讨肝脏巨噬细胞中NIMA相关蛋白激酶7（never in mitosis gene a⁃related kinase 7，NEK7）在肝脏纤维化组织中的表达及其通过对NOD样受体家族3（nucleotide⁃binding oligomerization domain⁃like receptors，NLRP3）炎症小体信号通路调控肝脏纤维化（liver fibrosis）的作用机制。方法：通过HE和Masson染色以及qRT⁃PCR技术观察对比正常人和肝纤维化患者之间肝脏纤维化程度的差异；采用Western blot和qRT⁃PCR技术检测正常人和肝纤维化患者肝脏组织中NEK7的表达；运用免疫荧光染色技术观察CD68阳性细胞中NEK7的表达情况。通过腹腔注射四氯化碳（carbon tetrachloride，CCl4）8周的方法建立小鼠肝脏纤维化模型，采用巨噬细胞特异性干扰RNA（small interfering RNA，siRNA）敲低巨噬细胞中NEK7的表达，取组织标本， 通过HE、Masson和天狼星红染色技术以及qRT⁃PCR技术，观察小鼠肝脏组织纤维化程度的差异；同时利用组织免疫化学染色和组织免疫荧光染色技术，观察小鼠肝脏炎症反应中中性粒细胞和巨噬细胞聚集程度的差异；进一步运用Western blot技术检测其对NLRP3炎症小体信号通路的影响。结果：NEK7在肝纤维化肝脏组织中表达明显高于正常肝脏组织；在体内特异性敲低巨噬细胞中NEK7的表达有助于减轻肝脏纤维化的程度和炎症反应以及抑制NLRP3炎症小体信号通路的激活。结论：抑制巨噬细胞中NEK7的表达能通过抑制NLRP3炎症小体信号通路，减轻炎症反应，阻止肝纤维化病变。

    Abstract

    Objective：This study aims to investigate the never in mitosis gene a⁃related kinase 7（NEK7）expression in liver fibrosis and its effect on nucleotide⁃binding oligomerization domain⁃like receptors（NLRP3）signal pathway to regulate liver fibrosis. Methods： HE staining，Masson staining and quantitative reverse transcription PCR（qRT ⁃ PCR）were used to evaluate those degree of hepatic fibrosis in normals and patients with cirrhosis. The expression of NEK7 in liver tissues of non ⁃ cirrhotic and cirrhotic patients was detected by Western blot and qRT⁃PCR. CD68⁃positive cells was determined by immunofluorescence tissue staining. To induce hepatic fibrosis，C57BL/6J mice were injected intraperitoneally with carbon tetrachloride（CCL4）twice a week for 8 weeks. C57BL/6J mice were injected through tail vein with macrophage⁃specific siRNA to knockdown the expression of NEK7 in macrophages. HE staining，Masson staining and sirius red staining were used to observe the changes of liver fibrosis in mice liver tissues. The level of the migration and aggregation of neutrophils and macrophages were monitored by immunohistochemistry tissue staining and immunofluorescence tissue staining. The impacts of NEK7 on NLRP3 signaling pathway were measured by Western blot. Results：In the fibrotic liver tissues， NEK7 expression was significantly higher than that in the normal tissues. Specific blockade of NEK7 in macrophages obviously attenuated liver fibrosis and hepatic inflammation in vivo. Specific blockade of NEK7 in macrophages also inhibited the activation of NLRP3 inflammasome signaling pathway. Conclusion：Inhibition of NEK7 may alleviate macrophage inflammation reaction and liver fibrosis through inhibiting NLRP3 inflammasome signaling pathway.

  • 慢性肝炎是肝硬化的主要病因，全球每年有100多万人死于肝硬化，目前中国有多达700万人患有肝硬化，而且患病人数不断增加[1]。肝硬化晚期患者通常由于肝功能受损、胃食管静脉曲张、腹水甚至肝细胞癌而导致预后不良[2]。

  • 巨噬细胞在很多人类疾病的发生与发展中起着重要作用，运用巨噬细胞的治疗方案已经用于许多不同的疾病当中，如肾病、遗传性肺泡蛋白沉积症和肝纤维化[3]。虽然巨噬细胞在肝脏纤维化中起重要作用已经被公认，但是巨噬细胞在肝脏纤维化的发生和发展中的作用机制尚不清楚[4]。

  • NOD样受体家族3（nucleotide⁃binding oligomer⁃ ization domain⁃like receptors，NLRP3）炎症小体信号通路可由多种炎症因子激活[5]，其中氧化应激产生的活性氧（reactive oxygen species，ROS）是NLRP3激活的关键因素。应激诱导的ROS通过调节相关信号通路进而诱导NLRP3激活来介导宿主防御反应[6]。 NIMA相关蛋白激酶7（never in mitosis gene a⁃relat⁃ ed kinase7，NEK7）则是通过NEK7⁃NLRP3的相互作用从而启动NLRP3激活的关键介质，以响应ROS[7]。NEK7和NLRP3之间相互结合促进炎症小体的组装以及NLRP3炎症小体的形成，进而导致含半胱氨酸的天门冬氨酸蛋白水解酶⁃1（cysteinyl as⁃ partate specific proteinase⁃1，caspase⁃1）的激活，白细胞介素（interleukin，IL）⁃1β的分泌和成熟[8]。因此， NEK7⁃NLRP3复合体可能在炎症反应过程中起到炎症小体感受器的作用。本研究即探讨NEK7在肝脏炎症及纤维化形成中的作用。

  • 1 材料和方法

  • 1.1 材料

  • 冷冻离心机（Eppendorf公司，德国）；Veriti PCR仪（Applied Biosystems公司，美国）；WIX mini电泳仪和酶标仪（北京Wix Technology公司）；Pannoram⁃ ic DESK扫描仪（3D HISTECH公司，匈牙利）；TRIzol （Invitrogen公司，美国）；RNA反转录试剂盒，SYBR Green PCR（南京诺唯赞生物科技有限公司）；免疫组化试剂盒、Masson、天狼星红染色试剂盒（上海碧云天生物技术有限公司）；胎牛血清、DMEM细胞培养基（Gibco公司，美国）；NEK7抗体（Abcam公司，美国）；ELISA试剂盒（杭州联科生物技术有限公司）； NLRP3、IL⁃1β、C⁃caspase⁃1和β⁃actin等抗体（CST公司，美国）；LY6G、CD11b和F4/80等抗体（武汉赛维尔生物科技有限公司）；NS ⁃siRNA、NEK7⁃siRNA、siRNA转染试剂盒（sc⁃61175，Santa Cruz Biotechnol⁃ ogy公司，美国）。

  • 所有肝脏标本取自南京医科大学第一附属医院肝切除患者。根据Metavir评分和病理组织报告对患者肝组织的样本进行分析。正常对照男3例，女2例，年龄（48.3±4.2）岁，肝硬化评分为0~1分；纤维化患者中，男4例，女1例，年龄（58.6±3.5）岁，肝硬化评分为3~4分。本研究得到南京医科大学第一附属医院伦理委员会的批准（伦理批号：2018⁃SRFA⁃197）。

  • SPF级8周龄的C57BL/6J雄性小鼠20只，均采购自南京医科大学动物中心。分笼试养，在室温下每天予以12h光照，自由饮水、摄食。

  • 1.2 方法

  • 1.2.1 小鼠分组和模型制备

  • C57BL/6J小鼠采用腹腔注射四氯化碳（CCL4， 10%橄榄油，2mL/kg，每周2次，共8周）建立小鼠肝脏纤维化模型组；对照组则采用C57BL/6J小鼠腹腔注射10%橄榄油。巨噬细胞特异性表达甘露糖受体，运用甘露糖偶联聚合物作为载体，将NS⁃siRNA和NEK7⁃siRNA与甘露糖偶联聚合体混合静置20min，在腹腔注射CCl4造模4h之前，通过尾静脉注射小鼠体内（siRNA 2mg/kg，每周2次，共8周），用于特异性干扰小鼠巨噬细胞中NEK7的表达。具体分组：橄榄油+NS ⁃ siRNA组，橄榄油+NEK7⁃ siRNA组， CCL4+NS⁃siRNA组，CCL4+NEK7⁃siRNA组，每组5只。

  • 1.2.2 组织免疫化学染色

  • 所有标本均用10%福尔马林液固定，常规石蜡包埋、切片，行免疫组化染色，梯度酒精脱水，丙酮固定，抗原修复，加入NEK7抗体过夜，第2天经PBST冲洗3次，加入二抗，室温孵育30min，冲洗3次。

  • 1.2.3 HE、Masson和天狼星红染色

  • HE染色：切片脱蜡处理后，使用苏木素染色液染色10min，蒸馏水洗涤，伊红染色液染色2min。进行乙醇脱水、二甲苯透明，封片剂封片。Masson染色：切片常规脱蜡，依次使用苏木素染色液、Mas⁃ son蓝化液和丽春红品红染色液染色后，弱酸工作液洗涤，行脱水、透明、封片剂封片。天狼星红染色：切片脱蜡，天狼星红染色液滴染1h，蒸馏水冲洗后，行苏木素染色液染核，行脱水、透明、封片剂封片。

  • 1.2.4 组织免疫荧光染色

  • 切片抗原抗体修复与脱蜡处理后，用固定液固定30min。洗涤液洗涤，用封闭液封闭60min，去除封闭液，用稀释的一抗4℃ 孵育过夜，去除一抗，用洗涤液洗涤。加入带有荧光标记的二抗避光孵育60min，洗涤液洗涤，DAPI染色60min，洗涤液洗涤，封片剂封片。

  • 1.2.5 Western blot检测

  • 取少量肝脏组织块并用剪刀尽量剪碎，加入500 μL裂解液后置于冰上裂解30min，4℃ 12 000g离心15min离心后取上清，BCA法测定蛋白浓度。将蛋白样本行SDS⁃PAGE，采用电转膜法将蛋白转移至NC膜上。采用快速封闭液封闭30min后，分别加入NEK7、IL⁃1β和C⁃caspase⁃1一抗4℃孵育过夜，次日加入二抗室温孵育2h，加入化学显影液曝光。

  • 1.2.6 qRT⁃PCR检测

  • 取小鼠肝组织研磨后加入TRIzol试剂提取组织总RNA，测定浓度，使用反转录试剂盒在37℃ 15min，85℃ 5s的条件下反转录得到cDNA。在避光条件下，将逆转录好的cDNA溶液1 μL，与0.2 μL的前引物，0.2 μL的后引物，5 μL的SYBR Green，以及3.6 μL无RNA酶的ddH2O配制成10 μL体系。采用2-ΔΔCt 值计算mRNA的相对表达量。每组试验均重复至少3次。相关引物序列见表1。

  • 1.2.7 提取纯化肝脏巨噬细胞

  • 用腹腔注射戊巴比妥的方法麻醉C57BL/6J小鼠，开腹，暴露肝叶下方的门静脉，将留置针插入其中，拔出针芯，灌注事先预热准备的37℃灌注液，肝脏充盈一段时间后，剪断下腔静脉，灌注到流出液体为清亮液体，再用事先预热准备的具有胶原酶的37℃灌注液，一直灌注至肝脏柔软。取出肝脏，去除多余组织，放置消化液中静置15min，通过无菌滤嘴过滤，收集过滤后的组织液体，50 g离心2min，取上清液体500 g离心8min，然后用培养基重悬沉淀，分别采用3mL的50%Percoll液、25%Percoll液和3mL的细胞悬浮液铺层，800 g离心15min，吸取中间一层至离心管中，500 g 离心8min，培养基重悬沉淀，铺板，30min后换液，留下贴壁细胞，用于West⁃ ern blot检测NEK7⁃siRNA的干扰效率。

  • 表1 qRT⁃PCR引物序列

  • Table1 Sequences of the primers for qRT⁃PCR

  • 1.3 统计学方法

  • 统计学分析及相关绘图通过GraphPad Prism 6软件实现。所有实验数据均以均数±标准差（x- ± s） 表示，两组间比较采用独立样本t检验，多组间比较采用单因素方差分析。P< 0.05为差异有统计学意义。

  • 2 结果

  • 2.1 NEK7在肝纤维化患者肝脏组织中的表达

  • 为了检测NEK7在正常肝脏及肝纤维化患者肝脏组织中的表达，分别取5例正常肝脏组织和5例肝纤维化患者肝脏组织包埋切片，通过HE和Mas⁃ son染色观察发现，肝硬化患者较正常肝脏组织肝纤维化更为明显（图1A）。通过qRT⁃PCR技术检测对比发现肝纤维化患者纤维化相关指标金属蛋白酶组织抑制因子1（tissue inhibitor of metalloprotein⁃ ases 1，TIMP1）和Ⅰ型胶原蛋白（Collagen ⁃Ⅰ）的RNA水平明显升高（图1B）。同时采用qRT⁃PCR技术及Western blot技术检测表明，NEK7mRNA和蛋白的表达水平在纤维化肝脏组织明显高于正常肝脏组织（图1C）。此外，通过免疫组织荧光染色技术发现CD68阳性细胞中NEK7的表达量显著增加（图1D）。这些结果表明在肝纤维化患者的肝脏组织中NEK7表达上调，尤其是在巨噬细胞当中。

  • 2.2 干扰小鼠巨噬细胞中NEK7的表达对肝脏纤维化的影响

  • 通过HE、Masson和天狼星红组织化学染色技术，观察到未经过腹腔注射CCL4的小鼠肝脏无明显纤维化，然而采用CCL4腹腔注射的小鼠当中，NS⁃siRNA组较NEK7⁃siRNA组纤维化明显（图2A）。同时采用qRT⁃PCR技术发现，NS⁃siRNA组较NEK7⁃ siRNA组纤维化指标Collagen、Collagen⁃Ⅰ、Ⅱ型胶原蛋白（Collagen ⁃Ⅱ）、TIMP1、转化生长因子⁃ β （transforming growth factor⁃β，TGF⁃β）的基因表达水平更高（图2B）。

  • 图1 NEK7在正常肝脏和肝纤维化患者肝脏组织中的表达

  • Fig.1 Expression of NEK7in liver tissues of normal and liver fibrosis

  • 2.3 NEK7 可通过NLRP3 炎症小体信号通路调控炎症反应和纤维化

  • 为了进一步探讨NEK7减轻炎症反应和肝脏纤维化发生和发展的机制，通过免疫组织化学染色和免疫荧光染色，检测了LY6G、CD11b和F4/80的表达，发现抑制巨噬细胞中NEK7的表达可以减轻肝脏纤维化时中性粒细胞和巨噬细胞的聚集以及炎症反应（图3A、B、C）。通过ELISA试剂盒检测各组小鼠血清中IL⁃1β水平的差异（图3D）。为了验证甘露糖偶联聚合体体系中NEK7⁃siRNA对肝脏巨噬细胞的敲低效率，通过肝脏灌注纯化获取肝脏巨噬细胞，并进行了Western blot实验加以验证，结果显示， NEK7⁃siRNA较NS⁃siRNA组巨噬细胞中的NEK7的表达明显被抑制（图3E）。同时我们测定了NLRP3、 IL⁃1β和C⁃caspase⁃1的蛋白表达，结果显示，NEK7⁃ siRNA组中相应表达量明显减少（图3F），因此认为NEK7可通过NLRP3炎症小体信号通路调控小鼠肝脏纤维化的发生和发展进程。

  • 3 讨论

  • 肝脏纤维化是慢性肝脏疾病的常见病理结果[9]。慢性肝炎的患者常可观察到过度肝脏纤维化。肝脏纤维化的发展是慢性肝病的主要并发症之一，其临床结局很多，如与肝纤维化相关的腹水和食管静脉曲张的发展相关联。有研究表明，在有纤维化病变的小鼠肝脏组织中NEK7的表达增加，然而，目前巨噬细胞中NEK7对纤维化的影响未见报道。此前，本团队[10-11] 以及Yue等[12] 都采用甘露糖偶联聚合体体系联合siRNA进行小鼠尾静脉注射，用于体内特异性干扰巨噬细胞内基因表达。其中Yue等[12] 研究证实了巨噬细胞中的热休克转录因子1（heat shock transcription factor，HSF1）通过NLRP3炎症小体信号通路调节小鼠肝脏缺血再灌注中的损伤，其对下游巨噬细胞中NLRP3的回复实验中，运用甘露糖偶联聚合体体系，在小鼠肝脏缺血再灌注造模4h前，通过尾静脉注射特异性干扰RNA抑制巨噬细胞中NLRP3的表达。证实了在缺血再灌注损伤模型中，抑制巨噬细胞中HSF1的表达可以促进炎症反应从而加重损伤。本文探究的NEK7已经被确定为NLRP3炎症小体激活的选择性上游调节因子[13]， NEK7可以通过激活NLRP3进而促进炎症反应。

  • 图2 抑制小鼠巨噬细胞中NEK7的表达可减轻肝脏纤维化的程度

  • Fig.2 NEK7deficiency in macrophages alleviates CCl4⁃induced liver fibrosis

  • 图3 NEK7可通过NLRP3炎症小体信号通路调控炎症反应和纤维化

  • Fig.3 NEK7can regulate inflammation response and liver fibrosis by NLRP3signaling pathway

  • 慢性肝损伤不仅由损伤剂对肝细胞的直接作用引起，还与伴随的先天免疫反应产生的细胞因子有关。肝脏炎症和纤维化是由复杂的免疫途径控制，因而涉及许多可能的治疗靶点。对炎症潜在机制的理解应该转化为临床治疗的方法[14]。最近的研究表明，巨噬细胞是先天免疫系统的关键组成部分，参加肝脏炎症反应。巨噬细胞的主要功能涉及细胞因子的产生，并共同构成一个高度复杂的免疫系统稳态网络。虽然肝脏巨噬细胞在肝脏纤维化的发生和发展中起着重要的作用，但其潜在的机制在很大程度上仍然是未知的。

  • 由NOD样受体形成的炎症小体中，NLRP3是最具有特征性的NOD样受体。NLRP3炎症小体是一个重要的信号转导节点，控制着IL⁃1β和IL⁃18这2个因子的成熟[15]。NLRP3炎症小体组装完成后，将休眠的pro⁃caspase⁃1裂解成活化的caspase⁃1。随后，caspase⁃1将细胞因子前体pro⁃IL⁃1β和pro⁃IL⁃18转化为成熟的、具有生物活性的IL ⁃1β和IL ⁃18。 NEK7作为在脊髓动物中发现的11种NEK激酶之一，属于调节有丝分裂进程中和DNA损伤反应的NIMA相关激酶（NRKs）家族，已经被确定为NLRP3炎症小体激活的选择性上游调节因子[13]。相应的， caspase⁃1的激活和IL⁃1β的释放在没有NEK7激活NLRP3炎症小体的信号转导下将被取消。因此，这说明了NLRP3⁃NEK7相互作用在NLRP3炎症小体激活中的特异性和重要性。本研究表明，NEK7缺乏可以通过减少巨噬细胞中细胞因子的产生来减轻CCL4导致的肝脏炎症。

  • 综上所述，本研究表明，肝纤维化患者较正常人肝脏组织中NEK7的表达上调，体内特异性抑制巨噬细胞中NEK7的表达可以通过NLRP3炎症小体信号通路来减轻肝脏炎症反应和缓解肝脏纤维化。本研究结果提示，NEK7可能在肝脏纤维化的发生发展起到关键性作用，可以作为临床上治疗肝硬化潜在的候选药物靶点。

  • 参考文献

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  • 基本信息

    中图分类号: R575.2
    文献标识码: A
    DOI: 10.7655/NYDXBNS20210505
    文章编号: 1007-4368(2021)05-663-08

    基金信息

    国家自然科学基金项目(81670570)；
    江苏省重点病种规范化诊疗研究项目(BE2016789)；

    引用信息

    稿件历史

    收稿日期: 2021-02-27

  • 参考文献

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